液体样本甘油含量测定试剂盒

描述：甘油是甘油三酯的水解产物。脂蛋白酯酶能够水解血液中的甘油三酯；胰脂酶可以水解食物中的甘油三酯；激素敏感脂肪分解酶能够水解脂肪细胞中的甘油三酯。与游离脂肪酸一样，甘油含量是甘油三酯水解反应的可靠检测指标，但检测更加方便。本试剂盒采用甘油磷酸氧化酶法与经典的GPO-Trinder 酶学反应方法，通过比色测定液体样本中的甘油含量。经过优化后，操作步骤更加简单，检测线性范围在10-1200µmol/L，可靠性和重复性俱佳，适合生物医学、食品实验室检测。

原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化为 3- 磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化产生过氧化

氢；在过氧化物酶作用下生色底物转化为苯醌亚胺，其光密度值与甘油浓度成正比。

 适用范围：测定血液，细胞培养基、体液、酒类饮料中的甘油浓度。

 组成： (105 次微板测定或 30 次 1 ml 比色杯测定)：

(1) R1 试剂 40 ml

(2) R2 试剂 10 ml

(3) 4 mmol/L 甘油标准品 1 ml ，4 ℃，储存6 月。

操作步骤：

一 样本处理：

1.       酒类、饮品、清澈液体样本：可直接进行测定，如超过线性范围可用蒸馏水或生理盐水稀释后再进行测定。

2.       培养液：取不含酚红、无颜色、无血清的细胞培养基，如有细胞碎片应4ºC,，12,000g离心5min,取上清进行测定。

3.       血液：对于新鲜抗凝血而言，可4ºC，2,000g离心5min得到血浆；而对于非抗凝血来说，可先4ºC静置2h得到血清后，2000g离心10min,除去血细胞。将得到的血浆/血清70ºC 加热10分钟灭活內源脂肪酶，12,000g离心10min ,去上清进行测定或-20ºC保存。

二 工作溶液配制：按4:1比例，取4 ml试剂R1与1 ml试剂R2混合即可，立即使用或4ºC保存<1天，变色弃去。

 三 标准品稀释：用蒸馏水、生理盐水或与样品缓冲液一致的液体，将4 mM甘油标准品倍比稀释为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L，通常取其中4~6管即可，注意设置0浓度对照反应管。

四 甘油浓度测定：

1.       加样。为使反应时间尽量一致，减小实验误差，可先加入标准品、待测样品，然后再加入工作溶液。（注意：当甘油浓度较低时，可将待测样品与工作溶液按照100µl:100µl体积进行混合，然后再进行测定，但是如果样品体积超过100µl时将会稀释工作液中酶的浓度，致使反应灵敏度下降。如果待测样品浓度超过线性范围的时候，可进行适当稀释，然后根据稀释倍数来计算样品中甘油浓度。）

2.       37ºC或25ºC反应 15分钟。反应平衡后颜色在60分钟内稳定。

3.       先用蒸馏水+工作液的空白管调零，然后测定各管OD值。

绘制标准曲线并计算甘油浓度。附Excel作图步骤：各标准管OD值为y轴，标准品浓度为x轴。(1)鼠标左键圈住数据，点击做图向导，选择-散点图-，点击-完成-。(2)鼠标右键点图上的某一点，点击-添加趋势线-，点击-选项-，点击-显示公式-和-R²值-。