1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔十孔，在*、第二孔中分别加标准品一百μl，然后在*、第二孔中加标准品稀释液五十μl，混匀；然后从*孔、第二孔中各取一百μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液五十μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取五十μl弃掉，再各取五十μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液五十ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取五十μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液五十μl，混匀后从第七、第八孔中分别取五十μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液五十μl，混匀后从第九第十孔中各取五十μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为五十μl，浓度分别为1800纳克/升，1200纳克/升 ，600纳克/升，300纳克/升， 1五十纳克/升）。

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品十μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置37摄氏度温育30min。

4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂五十μl，空白孔除外。

7. 温育：操作同3。

8. 洗涤：操作同5。

9. 显色：每孔先加入显色剂A五十μl，再加入显色剂B五十μl，轻轻震荡混匀，37℃避

光显色十五min. 

十. 终止：每孔加终止液五十μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后十五min以内进行。