一、介绍

高压液相色谱（HPLC）是分析化学和生物化学中常用的一种方法，用于将混合物中的化合物进行分离，以便进一步分析和纯化。

在HPLC过程中，混合物中的组分通过被泵送的溶剂（称为流动相）穿过装有硅基颗粒的柱子（称为固定相）来实现分离。每种组分（称为分析物）根据其在流动相和固定相之间的独牛寺亲和力，以不同的速度沿柱迁移，并在不同的时间从柱中流出，从而实现混合物的有效分离。

对流动相具有较高亲和力的分析物会沿着柱子迁移得更快，而对固定相具有较高亲和力的分析物则迁移得更慢。这种迁移时间（称为保留时间）对于每个分析物都是独牛寺的，可以用于其鉴定。通过在柱后适当使用检测方法，每个分析物也可以被定量分析。

较小的柱填料颗粒尺寸可以提高色谱分辨率，但需要增加溶剂输送压力。进一步减小柱填料颗粒尺寸可以允许更高的溶剂流速，从而在不牺牲分辨率的情况下减少分析时间。这正是超高效液相色谱（UHPLC）相对于其他液相色谱技术的优势所在。

基本类型的高效液相色谱柱化学：

• 正相色谱，例如硅胶颗粒

• 反相色谱，例如涂有C-18的硅胶

基本的流动相输送系统类型：

• 等度洗脱 - 使用恒定溶剂混合物，例如在整个分离过程中使用10%的水在甲醇中。

• 梯度洗脱 - 随时间变化的溶剂混合物，例如从纯己烷开始，然后逐渐增加乙酸乙酯的浓度，直到最后为纯乙酸乙酯。

高效液相色谱系统的基本组件包括溶剂输送泵、样品进样口、柱子和检测器。高效液相色谱的性能要求仪器具有典型液相色谱系统所不具备的特性。溶剂输送必须是无脉冲的，并且在1毫升/分钟到100微升/分钟的流量范围内准确校准。

注射泵通常被认为优于活塞泵，适用于需要低且稳定流速的高效液相色谱应用。Teledyne ISCO注射泵是这些高性能应用的优秀高效液相色谱泵。

图1：等度溶剂输送系统

二、理论

Van Deemter方程是理解色谱法基本原理的关键。根据Van Deemter方程：

H = A + B/µ + Cµ

其中：H是柱子的板高，µ是流动相的线性流速。A、B和C是常数。较小的板高H表示更高的分离分辨率。²

常数A是涡流扩散项。涡流扩散是由于柱中多条流动路径导致的，并且与流动相流速无关。由于填料颗粒的存在，分析物分子可以沿着不同长度的多条路径前进。这些不同长度的多重路径使分析物分子分散开来，并导致峰展宽。A项取决于固定相的紧密程度。固定相中的空隙会因通道效应导致峰展宽。相比之下，较小的填料颗粒提供更小的路径长度差异，从而减少峰展宽。

B是纵向扩散系数。它依赖于分析物分子在流动相中的扩散系数。更快的流动相流速减少了停留时间，而分析物分子在柱中的较短停留时间减少了纵向扩散的影响。这种减少有助于提高分离效率，因为分析物分子通过扩散散开的机会更少，这解释了1/v因子。

C是分析物质量传递系数。它取决于分析物分子在移动相和固定相之间达到平衡所需的时间。如果这种平衡太慢，那么一些未能及时与固定相结合的分析物分子将会随流动相流下柱；而那些未能及时从固定相脱离的其他分子则被留下。更高的流动相流速会导致分析物分子的扩散，因此解释了v因子。较小的固定相颗粒预计会有更短的平衡时间。

如上所述，较小的固定相颗粒或珠子应该会降低A和C值。A项对H的贡献较小，允许更高的分辨率。随着C项对H值的影响变得不那么显著，增加流动相流速不会太多牺牲分离性能。这将允许在相同的分辨率下进行更快的分离。尽管较小的柱珠可能不会直接影响B值，但较高的流速减少了其对H的贡献。较小的柱珠将允许在更高分辨率下进行更快的分离。³

较小的珠子将以较小的间隙填充，从而减小A值，但提供更高的溶剂流动阻力。反过来，这需要更高的溶剂压力。随着蕞优分离流速的增加，柱背压随固定相颗粒尺寸的立方成反比增加；即P∝1/d³。⁴通常，对于5 µm柱珠的HPLC需要1,000 psi的压力，而对于1.7 µm柱珠的UHPLC则需要20,000 psi或更高的压力。^1,4

图2：梯度溶剂输送系统

三、HPLC泵

往复式泵通常配有单活塞或双活塞。活塞扫过的体积通常较小，约为100 µL。由于体积小，需要频繁补充液体，导致周期性压力下降。双活塞泵比单活塞泵产生更平稳的流动，但并非总是理想的选择。注射泵蕞适合要求高压、无脉冲和精确流动的高性能应用。注射泵具有更大的缸体容积，高达1 L，并且在运行期间通常不需要重新填充。因此，基线更加稳定，没有周期性的压力下降。理想的泵应能够在等度或梯度模式下操作。

表1：常用推荐的HPLC泵

四、引用

1) Y. Shen and R.D. Smith, Electrophoresis 23 (2002) pp. 3106-3124.

2) D.A. Skoog and D.M. West, Fundamentals of Analytical Chemistry, 3rd edit., pp. 643-649.

3) D. Sievers, M.E. Swartz and B.J. Murphy, G.I.T. Laboratory Journal 5(2004) pp.43-45.(2004) pp. 503-504

4) L.A. Colon, J.M. Cintron, J.A. Anspach, A.M. Fermier and K.A. Swin-ney, The Analyst 129

5) L.R. Snyder, J.J. Kirkland and J.L. Glajch, Practical HPLC Method Development, 2nd edit., pp. 41-43.

6) J.C. Giddings, Dynamics of Chromatography: Part I Principles and Theory (Marcel Dekker, Inc., New York: 1965) pp. 25-26, 229-230.

7) J.M. Cintron and L.A. Colon, The Analyst 127 (2002) pp. 701-704.A.D. Jerkovich, J.S. Mellors and J.W. Jorgenson, LCGC 21 (July 2003) pp. 600-611.