单细胞RNA测序技术（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）已被广泛应用于免疫学研究中，通过从单细胞水平解析免疫细胞亚群异质性，极大地促进了我们对免疫相关亚群的理解。调节性T细胞(Regulatory T cells, Treg)是控制免疫稳态*的细胞，具有治疗自身免疫的临床潜力。通过研究得知体外实验时，一些条件会使部分Treg失去Foxp3转录因子的表达，而获得效应T细胞(Teff)的特性，这一过程被称为Treg可塑性。免疫应答过程中这种可塑性的程度和可逆性尚不清楚。今天向大家分享一篇近期发表在Science immunology（IF 17.727）上，利用scRNA-seq鉴定Unstable Treg亚群相关研究的文章“Unstable regulatory T cells, enriched for naïve and Nrp1neg cells, are purged after fate challenge”。

技术亮点
1.BD Rhapsody单细胞多组学分析系统
2.Rhapsody 靶向mRNA & AbSeq扩增试剂盒（TTA）
3.BD Abseq寡核苷酸偶联抗体
4.BD Rhapsody小鼠多样本标记试剂盒（SMK）
5.BD Rhapsody Analysis Pipeline

研究结果

1.体内微生物生理刺激对ex-Foxp3细胞无诱导作用

研究者在本文中通过构建遗传诱导命运图谱小鼠技术(图1A)验证ex-Foxp3的产生（图1B），在微生物/抗原暴露下，无特定病原体的小鼠（SPF）与野生型小鼠（Co-house）体内都会产生数量相近、性能一致的ex-Foxp3细胞（图1C-J）。

 
2. 发现ex-Foxp3细胞是Treg中的一群unstable Treg亚群

通过遗传诱导命运图谱小鼠过继转移模型验证，发现ex-Foxp3细胞是Treg中的一群unstable Treg亚群（图2A，B，D），会在免疫缺陷的状态下转化生成(图2F)
 

图2 Ex-Foxp3细胞的形成是非随机事件，体内unstable亚群清除后Treg的稳定性升高

3. Ex-Foxp3细胞对Treg表达的谱系无命运记忆
 进一步通过体外Treg极化条件下培养ex-Foxp3细胞（图3A，B）、以及通过改进的遗传诱导命运图谱小鼠过继转移模型进行体内验证（图3C-F），发现该ex-Foxp3细胞会持续保持炎症效应，而且对Treg表达的谱系再无命运记忆（图3）。

图3 在体外和体内，ex-Foxp3细胞表现出有限的命运记忆

4. 单细胞多组学技术鉴定潜在的Unstable Treg亚群

BD Rhapsody单细胞多组学技术：TTA（214）+Abseq（5）+SMK

即使损伤改善后、炎症环境消除，ex-Foxp3细胞炎症状态也会持续存在，所以能表征出这个原始异质性的Treg亚群很重要。

基于流式技术获取的动力学数据，研究者评估了Foxp3缺失前Tregs基因表达的变化, 选取Tregs (未处理的Foxp3YFP-CreRosaRFP 命运图谱小鼠中获取的CD4+ YFP+ RFP+细胞)和将Foxp3YFP-CreRosaRFPTregs和同源naïve T细胞共转移到Rag1KO（免疫缺陷型）小鼠体内后在第5, 10, 和 15天获取 CD4+ YFP- RFP+ ex-Foxp3细胞(图4A和图S10A)。降维聚类(UMAP)分析产生6个细胞亚群(图4B)。Foxp3基因在所有ex-Foxp3细胞群体中均无表达，与分选报告相对应(图4C)。依据不同时间点样本进行差异表达分析，发现了三大类基因:快速丢失基因（Treg相关marker）、瞬时富集基因（稳定性丧失中起主要作用的基因）和后期富集基因（高度激活的表型相关基因）(图4D)。

图4（A-E） 单细胞多组学技术鉴定潜在的Unstable Treg亚群

为了深入了解不稳定Treg亚群的起源，研究者进行了基于Pearson相关关系的网络分析(r 0.95)，以识别第0天与第5天ex-Foxp3细胞最相似的Treg(图4F)。Inter Treg被确定为富含Unstable Treg的候选亚群，该亚群表达了88%的Treg特征基因，因此Inter Treg群体仍然代表真正的Treg。

图4（F） 单细胞多组学技术鉴定潜在的Unstable Treg亚群

Inter Treg富集了naïve Nrp1- Treg(图4G)，流式细胞仪显示类似，脾脏naïve细胞富含Nrp1- Treg (图4H)。在22%的第0天Treg中检测到Nrp1的表达（依据共表达基因为基础，可推断出占群体的89%），只有13%的Inter Treg细胞和7%的第5天ex-Foxp3细胞中检测到Nrp1 (图4I)。然而，在Inter Treg亚群中分为Nrp1+和Nrp1neg两组，Nrp1+和Nrp1-细胞与第5天ex-Foxp3细胞的关联性都很高，而与第10天ex-Foxp3细胞的关联性很少(图4I右图)。第5天ex-Foxp3细胞表达高水平CD62L(图4E)。在所有Inter Treg差异表达的基因Nrp1在CD62Lhigh部分中特异下调。总之，这些数据提出了一个假设，naïve Nrp1- Treg是异质性Treg细胞群中存在的亚群，在淋巴细胞降低的环境下最容易转化。

图4（G-I） 单细胞多组学技术鉴定潜在的Unstable Treg亚群
 

5. 淋巴细胞减少后pTreg和tTreg中unstable Treg亚群分析

Nrp1表达缺失被认为是外周诱导的Tregs (pTregs)富集的原因。通过BAC-Foxp3Cre-GFP改进的遗传诱导命运图谱小鼠过继转移模型, 将Treg亚群作为一个整体进行流式分选：BAC(GFP)+ Foxp3(Thy1.1)+亚群(tTregs，胸腺来源型Tregs)；BAC(GFP)- Foxp3(Thy1.1)+亚群(pTregs，外周诱导型Tregs)（图5B）。验证发现，与tTregs相比，pTregs中富含unstable Treg（图5C）。活化状态不影响Nrp1- Treg的不稳定性（图5E）。但从ex-Foxp3细胞群形成的绝对数量来看，这两个Treg来源的ex-Foxp3百分比几乎贡献值同等(图5F)，并且tTreg部分的不稳定性可能主要源于早期和不*确立的新的胸腺转移细胞（RTE）Treg（图5D）。

图5 淋巴细胞减少后pTreg和tTreg中unstable Treg亚群分析

单细胞多组学平台
BD Rhapsody™
BD Rhapsody™ 单细胞多组学分析系统能够对成千上万个单细胞的蛋白与基因进行数字定量，提供灵活的定制化Panel及标准化应用方案，以满足不同的实验需求，其*的混样技术可有效节约时间与成本。

系统组成包括：
BD Rhapsody™ 扫描仪
BD Rhapsody™ 上样台
BD Rhapsody™ cartridge（微孔板）   
分子标签试剂和文库制备
全转录组检测试剂盒/靶向RNA检测试剂盒/定制试剂盒
Abseq蛋白检测试剂盒
多样本混样检测试剂盒
VDJ检测试剂盒
单细胞测序数据分析软件BD SeqGeq