人外周血TH1/TH2/TH17染色

注意：采集外周血的抗凝管必须是肝素抗凝管，刺激剂尽量选用冻干粉自己配置；cocktail刺激剂是液体形式，PMA会因保存不当导致活性降低，影响刺激效果，而冻干粉形式的PMA较稳定，可以保证刺激效果。

人外周血TH1/TH2/TH17染色/流式检测方法

细胞刺激步骤：（刺激体系1ml）

取人外周血（肝素抗凝）200 ml加入24孔板内，加入800 ml的*培养基，再加入1ml PMA(25ug/ml)、1μl Ionomycin（1mg/ml），轻轻吹打混匀细胞。放入 CO2培养箱培养刺激0.5小时后，每孔再加入2μl Brefeldin A（5mg/ml），轻轻吹打混匀细胞，放入CO2培养箱培养刺激3.5小时。

流式检测步骤：

1、收集细胞于流式管内，500 g/8min离心，枪头吸去上清，弹散管底沉淀，加入相应的表面染色抗体（CD3\CD8），弹散混匀。室温避光孵育15分钟后，500 g/8min离心，枪头吸去上清；

2、弹散管底沉淀，加入1ml的固定/破膜工作液，（1ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixation/Permeabilization  Diluent稀释），旋涡混匀,现配现用；

3、室温避光孵育30分钟， 600 g/10min离心，在吸水纸上倒扣流式管弃去上清（此时细胞已在管底形成很牢固的沉淀，不容易丢 失），弹散管底沉淀；

4、加入1ml Permeabilization Buffer(此为10X，须与蒸馏水1：10稀释成工作液)工作液离心洗涤细胞，破膜15分钟（室温避光）， 600 g/10min，在吸水纸上倒扣流式管弃去上清，弹散管底沉淀；

5、加入100μl Permeabilization Buffer（1x），同时加入相应的细胞因子染色抗体，室温避光孵育15分钟；

6、加1ml Permeabilization Buffer（1x），600 g/ 8min；在吸水纸上倒扣流式管弃去上清；弹散管底沉淀；

7、加入适量体积（建议300~500 ml）的PBS重悬细胞，并上机检测并分析。

注意：1、根据实验需求选择相应的抗体，并做单染管用于调节补偿（具体如何设置单染管，可参照Biogems流式手册补偿章节介绍）。

     2、尽量做同型对照，因细胞因子表达量不高（尤其是IL-4表达量非常低），细胞因子抗体对应的同型对照一般都要做。

     3、PMA刺激会导致人T细胞表面CD4表达的下调，PMA与Lonomycin联合刺激下调非常明显，4h刺激后会下调50%以上，6h刺激几乎检测不到CD4，因此我们的界定CD4+T细胞是通过染CD3和CD8，来圈CD3+CD8-的细胞。

     4、PMA对小鼠T细胞CD4表达影响很小，因此可以直接染CD4来圈门。

     5、因破膜剂对细胞损伤较大，建议离心后形成的细胞沉淀先弹散形成细胞悬液，在加入破膜剂，这样会减少对细胞的损伤（形成的细胞碎片较少）。

人外周血TH1/TH17染色结果

注意：细胞破膜后对形态影响较小，因此可以直接圈淋巴门分析，在通过圈CD3+CD8-的细胞（此处未列出图）来分析CD4+的细胞表达细胞因子的量。因此此图横坐标就直接标的CD4。

人TH1/TH2/TH17染色所需抗体及辅助试剂

方案提供：Biogems*。Biogems是PeproTech的流式抗体品牌，优势是基于优异品质的较低价位，现正进行一系列*活动。

TH1/TH2/TH17流式抗体检测配色方案产品由重庆市华雅干细胞技术有限公司授权代理，：

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