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UDI? UMI?文库构建试剂盒如何选择

时间：2020-10-10 阅读：2221

相信有些小伙伴已经隐隐约约有听说过UDI和UMI这两个英文缩写，但是一直没搞清楚它们全名是啥？它们能干啥？

在正文开始前，我们先来“揭秘”UDI和UMI的全称：
UDI的全称为Unique Dual Index，译为双端不重复标签技术。
UMI的全称为Unique Molecular Identifier，译为分子条形码或者分子标签技术。
别急，要弄清这两个概念，还得从二代测序的那些事情说起：
我们都知道二代测序技术是近十年来曝光率非常高、非常受关注的基因组分析技术。以Illumina为代表的测序仪厂商不断推出更新型号的测序仪，不断刷新测序通量，但不变的仍是多样本混合后测序的策略。
要实现对多个样本同时测序，必须在各样本PCR扩增阶段，往核酸片段上添加一段分子序列作为样本标签，这种标签叫做index。

这样，每个样本就带上属于它的“专属号码牌”，在多样本混合测序后，生信工程师能通过“翻牌”，确定这个“号码”所代表的就是“寻寻觅觅”的那个“它”。

Index一般由8位碱基所组成，常有单端与双端两种添加模式，为了增加同时上样的通量，大家一般在面临大量样本同时测序时，会选择双端index↓

目前常用的双端index策略是通过少数几种index序列排列组合，去实现更多样本的标签区分（如96种），但这种方式一直存在交叉污染的可能。

同时，为了进一步提升通量与扩增效率，降低测序成本，Illumina为Novaseq等高通量型测序仪引入了图案化流动槽（Patterned Flow Cell Technology，PFCT）和排他性扩增（Exclusion Amplification，ExAmp）成簇技术。这两个看似美好的技术却无意间放大了一种叫做标签跳跃（index hopping）的样本标签错配的现象，导致科研人员无法正确拆析样本与数据的关系，终可能与重大发现“失之交臂”。

为了降低标签跳跃，Illumina在可以使用UDI双端特殊标签对样本进行标记，混样后进行测序。

UDI的引入使得文库两端的index序列是不重复，一对一组合的，不存在共用。换句话说，只有两端带有*正确index序列的reads才能进入后续的样本分析，从而可以剔除标签错配的reads，有效避免样本之间的数据串扰。

一句话总结：采用UDI策略，能更正确拆解测序数据与样本之间的一一对应关系，减小样本“戴错号码牌”的概率。

下面再来讲讲名为分子标签技术的UMI：

UMI的原理就是给每一条原始核酸片段加上一段*的标签序列，经PCR扩增后一起进行测序。这样根据不同的标签序列，生信人员就能区分不同来源的DNA模板，分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变，哪些是患者真正携带的突变，从而提高检测灵敏度和特异性。

一些需要较高正确度的应用，如肿瘤稀有突变分析，常会对5%、甚至1%左右的稀有变异作检测。这时一旦出现测序错误、或者PCR偏差，便会产生大量假阳性结果，因此需要添加UMI进行校正。

一句话总结：做稀有突变检测、校正测序错误与PCR偏差，UMI“劳苦功高”。

看到这里，关于UDI和UMI的介绍已基本完成。

接下来我们来看一个实际案例应用。

近我们收到一位宝粉的来信，咨询我们Takara有没有什么好的文库构建方案↓

我们了解到这位宝粉的团队
① 近正在研发肿瘤稀有突变分析的项目；
② 样本类型主要是FFPE(石蜡包埋样本)、cfDNA（游离DNA）；
③ 起始量大概在几十ng；④准备自己建库，然后送样测序，平台是Novaseq；
⑤ 由于是刚接触建库实验，不希望操作太复杂。
我思考了大概1秒钟，就从我们丰富的DNA-Seq文库构建产品线中找到了一款合适的产品↓

ThruPLEX Tag-Seq HV

为什么说这款产品合适呢？我们来对标这位宝粉的几个需求。

需求1：希望操作简便，不要太繁琐

对标1：ThruPLEX Tag-Seq HV这款试剂盒支持单管、三步操作，手动15 min，全程2 h，无需在建库过程中转管或纯化。

我们比较了ThruPLEX HV和K、N两家公司的试剂盒，只有ThruPLEX是单管操作、时间短、操作便捷的系统。

所以，无论新手还是老手，都能很快上手！

需求2：样本类型为FFPE DNA、cfDNA，起始量大概在几十ng

对标2：ThruPLEX Tag-Seq HV支持5-200 ng FFPE DNA、cfDNA起始，input volume为30μl，无需样品浓缩。

需求3：Novaseq测序分析稀有变异

对标3：ThruPLEX Tag-Seq HV搭配UDI建库，可以有效降低index hopping效应，是高通量型Illumina测序仪的“友好伙伴”

ThruPLEX Tag-Seq HV茎环形接头上还包含7位碱基的固定型UMI，双端总共可有144种UMI连接到DNA分子两端，以识别一致序列，减少扩增或者测序错误带来的假阳性突变。

再举几个例子

Takara科学家采用ThruPLEX Tag-Seq HV对10 ng起始的Quan-Plex Patient-Like ctDNA标准品（AccuRef）构建文库，肿瘤相关的基因采用IDT xGEN Pan Cancer Panel进行捕获富集，随后用UMIs鉴定了ctDNA标准品中特定位点的实际突变频率。结果显示，检测到的突变频率分别与预期1%、5%的等位突变频率接近，而阴性对照组没有在位点处检测到任何突变。

同时，为了比较UMI与常规使用的坐标法之间的效果差异，Takara科学家先使用未去重或者仅用坐标法去重的文件分析，在预期的EGFR L858R突变附近观察到大量的低频及随机等位基因频率突变。而随后用UMI校正、过滤数据后，清除了假阳性突变，得到了预期的突变分析结果！

经过几场对标，我们明确了ThruPLEX Tag-Seq HV能满足那位宝粉开发cfDNA/FFPE DNA稀有突变项目的需求。

当然，若小伙伴们也有同等需求，ThruPLEX Tag-Seq HV定能不负所望。