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KAPA建库产品助力2019-nCoV病毒宏基因组研究

时间：2021-02-04 阅读：1395

2019-nCoV疫情牵动着每一个人的心，目前除了一线疫情确认在进行大量检测之外，溯源、复核、监控疫情病毒变异的工作也在同步开展，在短期内，中国科学家以非凡的速度，分离并解析了病毒全基因组序列，为进一步分析其传染机理，传播途径，药物靶点等提供了支持，这一切的工作都离不开基于高通量测序的宏基因组病原体检测。

宏基因组测序（mNGS）解析

宏基因组病原体检测是对感染样本进行文库构建和高通量测序，通过病原数据库比对，获得致病微生物的种属信息，对未知病原或已知变异较大病原进行识别，为传染病防控带来新的思路并提供指导临床治疗的报告。

根据提取核酸的种类不同，宏基因组病原体检测分为DNA检测流程和RNA检测流程。

DNA检测流程适用于胞内寄生的细菌如结核分枝杆菌、细胞壁较厚的真菌如隐球菌等病原的检出。
RNA检测流程适用于流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒等RNA病毒的检出。本次病毒鉴定即是通过宏基因组测序RNA流程进行的。

宏基因组测序的临床应用

病原检测：未知病原微生物增加了临床诊断难度，无法进行有效治疗，导致患者病情加重甚至死亡。基于宏基因组学的测序在未知病原检测中发挥日益重要的作用。

病原监测与溯源：对特定地区或人群的临床样本进行宏基因组学测序，监测潜在致病病原，对可能出现的疫情进行预测预警，对病原进行追溯，找到潜在传播途径，及时确定和切断传染源。

宏基因组测序面临的挑战

高通量测序病原宏基因组检测的前处理环节只涉及核酸提取和测序文库构建，不存在病原培养中出现的时滞，在病原微生物的检测中有着明显的优势，能够更好应对临床病原诊断需求，但是也依然面临不少挑战，其中，测序文库构建关键并且难度大。

先天不足：病原样本深藏在大量宿主和其它微生物之内，临床病原常为起始量低，背景噪音大的复杂样本，大量宿主信号掩盖了微量病原信号，致使敏感性偏低，难以有效区分。

后天潜忧：文库构建涉及到基因组打断，测序接头链接，全基因组扩增等多个步骤，每一步骤的目标是要每个分子都以相同的效率执行每个步骤，打断有损失，连接有差别，扩增有偏好，都会带来检测误差。

宏基因组检测失败的原因

核酸机械打断，损失较大，导致潜在病原信息丢失
连接效率较低，文库构建中核酸分子多样性和文库复杂度的丢失，导致假阴性结果
建库过程PCR步骤，特别是GC含量较高和较低的区段，扩增不均一，覆盖不到位

众志成城 共克时艰

文库构建在宏基因组病原检测中重要的指标是核酸分子的复杂度和成库产物的均一度，既要保证痕量目标病原的存在，又要保证目标病原不会因扩增过程的不均匀性比例过低，在后续测序中被遗漏。

KAPA宏基因组测序产品应用方案解析

宏基因组DNA检测流程：KAPA Hyperplus酶切法DNA文库构建试剂盒，无需机械法打断仪器，样本损失量小，操作简单，可根据测序长度，进行片段大小调整，同时提供了更高的转化效率及更低的扩增偏差(KAPA HiFi)，从而获得更均一的全局序列覆盖度。

宏基因组RNA检测流程：正常起始量样本，推荐采用KAPA核糖体RNA去除试剂盒 (人/大鼠/小鼠)去除宿主rRNA，之后采用KAPA RNA Hyper文库构建试剂盒进行文库构建。对于微量样本，则推荐利用SMART-seq2方法反转录为cDNA，采用KAPA HiFi扩增cDNA，扩增后的cDNA再采用 KAPA DNA Hyperplus进行DNA文库构建。

KAPA DNA和RNA建库产品目前已广泛应用在宏基因组病毒测序中，可参考文末文献引用^[4]^[5]。

KAPA产品应用亮点

复杂临床病原样本建库效率高，确保病原的获得^[2]
文库扩增覆盖度、均一性好，PCR 重复度低，使得各种GC含量的病原均衡富集^[1]
宿主rRNA去除效率高，显著减少背景噪音，将更多测序reads用于病原而非宿主^[3]
IVD级别质控，产品品质稳定、批间差小，在大量各异的临床样本前表现稳定
优化建库步骤，缩短实验时间，快速获得文库用于后续测序^[1]
完美兼容自动化工作站建库方案，规模化应对疫

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文献引用

1. Aigrain, L., Gu, Y., & Quail, M. A. (2016). Quantitation of next generation sequencing library preparation protocol efﬁciencies using droplet digital PCR assays-asystematic comparison of DNA library preparation kits for Illumina sequencing. BMC genomics.

2. Ring, J. D., Sturk-Andreaggi, K., Peck, M. A., & Marshall, C. (2017). A performance evaluation of Nextera XT and KAPA HyperPlus for rapid Illumina library preparation of long-range mitogenome amplicons. Forensic Science International: Genetics.

3. Herbert, Z. T., Kershner, J. P., Butty, V. L., Thimmapuram, J., Choudhari, S., Alekseyev, Y. O., ... & Gillaspy, A. (2018). Cross-site comparison of ribosomal depletion kits for Illumina RNAseq library construction. BMC genomics.

4. Deng, Y., Cai, W., Li, J., Li, Y., Yang, X., Ma, Y., ... & Sun, M. (2019). Evaluation of the genetic stability of Sabin strains and the consistency of inactivated poliomyelitis vaccine made from Sabin strains using direct deep-sequencing. Vaccine.

5. Grubaugh, N. D., Ladner, J. T., Kraemer, M. U., Dudas, G., Tan, A. L., Gangavarapu, K., ... & Prieto, K. (2017). Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature.

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