1.  引言

动态光散射 (DLS) 是检测蛋白质粒径的标准工具，但该方法不提供浓度信息。AccuSizer® 单粒子光学传感技术 (SPOS) 系统可用于检测聚集蛋白粒径和浓度，可测量150nm以上的聚集蛋白浓度。图 1 显示了单抗产品热应激前后的 Nicomp® DLS 结果。

加热后的结果（蓝色）显示了高分辨率的多峰结果，包括从~150 nm开始的较大的聚集峰。AccuSizer 无法检测到 10 nm 的颗粒，但可以提供 >150 nm聚集蛋白的定量数据。在这项研究中，AccuSizer FX Nano 用于研究各种配方稳定化学物质如何影响NIST标准蛋白质的最终聚集状态。AccuSizer FX Nano也可用于 USP <787> 亚可见颗粒物测试¹。

2.  材料

使用的蛋白质是 NIST 标准物质 8671，批号 14HB-D002，NIST mAb，人源 IgG1k 单抗²。在Nicomp动态光散射(DLS)系统上，使用35mw激光二极管源，APD检测器测量蛋白质的初次粒径。在配备两个传感器的AccuSizer FX Nano SIS系统上测量蛋白质聚集体:LE-400; 0.5 – 400 μm 和 FX Nano; 0.15 – 10 μm.SIS进样器提供精确的样品体积，最小进样量低至100 μL且可回收。

iFormulate³（图 2）板预装了配方，由 DoE 设计用于合理的配方开发，用于测试配方的聚集水平。评估了蛋白配方的四个主要影响因素；pH、离子强度、缓冲液和稳定剂浓度。

使用的 iFormulate 板测试了以下影响因素：

• pH：5 – 7.6

• 离子强度：0 – 200 mM NaCl

• 海藻糖稳定剂：0 – 10 %

• 缓冲液浓度：10 – 50 mM

3.  方法

将 NIST mAb 解冻并稀释至 1 mg/mL，将 160 μL 过滤的去离子水添加到 iFormulate 板的每个孔中。每孔加入40 μL NIST mAb。将培养皿置于60°C(刚好低于蛋白质熔点)的烤箱中24小时。使用 AccuSizer 颗粒计数器分析每个孔。将>0.15 μm(总)和>0.53 μm的颗粒计数数据提交给iformula，由iformula进行数据分析和稳定性建模。

4.  结果

数据使用帕累托分析方法处理，帕累托分析方法在多影响因素下十分有效。帕累托分析给出了影响因素排名和影响因素之间的相互作用。图 3 和图 4 分别显示了 >0.15 μm 和 >0.53 μm 的帕累托分析。颜色表示配方变量对增加的颗粒计数的相对重要性，蓝色 = 重要，灰色 = 临界，红色 = 不太重要。

下面的结果显示了不同条件下聚集效应的 3D 响应曲面图。这种设计空间提供了通过检测在两个粒径范围内颗粒浓度的方法，以此来确定可最大限度减少聚集配方。图 5 和图 6 显示了在保持缓冲液和 NaCl 浓度不变的情况下，改变 pH 值和稳定剂（海藻糖）的结果。

图5 pH值和稳定剂的影响>0.15μm

图6 pH值和稳定剂的影响>0.53μm

图 7 和图 8 显示了不同 NaCl 和稳定剂（海藻糖）浓度的结果，同时保持缓冲液浓度稳定且 pH 值从 5.91 略微变化到 6.3。

图7 NaCl和稳定剂的作用>0.15μm

图8 NaCl和稳定剂的作用>0.53μm

然后对这些结果以及此处未显示的其他结果进行整理，图9和图10显示了最小粒子数优化图。

图9 颗粒最小化图>0.15μm

图10 颗粒最小化图>0.53μm

5.    结论

此处显示的结果表明，可减少颗粒计数并因此减少蛋白质聚集的最佳化学制剂为：

pH = 6.1 – 6.3

NaCl = 40 – 70 mM

海藻糖 = 7 – 8%

缓冲液 = 50 mM

AccuSizer也可用于在≥10和25μm的条件下进行USP＜787＞测试，并可使用A2000 USP微孔板分析仪实现自动化。

参考资料

[1] USP <787>, Subvisible Particulate Matter in Therapeutic Protein Injuctions, see usp.org 

[2] NIST reference material 8671, Lot 14HB-D-002, NIST mAb

[3] iformulate

[4] AccuSizer A2000MPA