荧光显微镜常用的激发光源

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）在收到紫光外或者蓝光激发时，发射绿色荧光，可在各种异源细胞，如细菌/昆虫以及植物细胞中表达，在植物研究中，通常需要各种显微镜来确定该基因是否表达，偶尔也会因为植物自发荧光导致假阳性的误判。荧光显微镜常用的激发光源甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。

绿色荧光蛋白在紫外线的激发下发光

GFP是从水母分离出的一种天然荧光蛋白，分子量约27000。为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽，其荧光发射峰在509nm，zui大激发波长为395 nm，并在470 nm处有一肩峰，GFP的化学性质相当稳定，其变性需在90℃或pH<4．0或ph>12．0的条件下用6mol／L盐酸胍处理。GFP的荧光发光有两个明显的吸收带，对应于GFP的两种不同构象的基态A和B。基态A对应于395nm的吸收峰，基态B对应于475nm的吸收峰，基态A占优势，基态B的分子数量约是基态A的1／6，两种基态间能缓慢地转换，但激发态A 之间的转换很快且发生了质子转移，A 快速高效地衰变至另一激发态，应该存在一个中间过度态I，质子转移使A 转变成I ，I 回迁到基态I时产生发射峰504nm的荧光，构象改变使I 转变成B ，由B到B发射荧光而不发生质子转移。目前，对于GFP的作用机理较为认同的仅仅是：GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是zui终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。

图一：绿色荧光蛋白在LUYOR-3415RG激发光源的激发下发光

除此之外，LUYOR-3415实验室灯还可以用做以下用途：

1、 野外、实验室原位测定RFP(红色荧光蛋白)。

2、 应用于转基因作物研究。

3、 区别可遗传性改良生物体和不可遗传的改良生物体。

4、 用于基因表达的研究。

5、 用于Rhodamine（红色荧光染料）、叶绿素、荧光素的研究。

为什么蓝光和紫外线激发光源能激发GFP发出绿色荧光？

绿光蛋白GFP吸收的光谱峰值为395nm（紫外），并有一个峰值为470nm的副吸收峰（蓝光）；虽然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于长波能量低，细胞忍受能力强，更适合活体检测，因此通常多使用蓝光波段光源（多为488nm）。GFP发射光谱zui大峰值为509nm（绿光），并带有峰值为540nm的侧峰（Shouder）。

图二：LUYOR-3280UV紫外激发光源

为什么蓝光和紫外线激发光源能激发GFP发出绿色荧光？

荧光蛋白GFP发光原理

荧光蛋白发光类型属于斯托克斯位移型，其基本原理是生色团在较高能量的光子照射下发生构象的改变，从而导致分子能级变化，从高能级的构象跃迁向低能级时发出较低能量的光子。生色团在发光过程中主要有两种化学过程。一是质子转移，即质子化和去质子化，二是分子构象的改变。生色团主要有三种构象：A型、B型以 及中间过渡态Z 型。在分子构象变化的同 时还伴随着氢键的生成和断裂，以及电荷的传递去质子化和质子化的分子构象不同， 对应的分子能级也不同，从而其发射光谱中有两个特征峰，代表两种跃迁过程。质子化构象生色基团通过Tyr66 的脱质子状和质子化状态(酚羟基)的转换决定荧光发射。由于酚的激发态酸性远大于其基态, 故仅脱质子态的结构发射荧光。这个过程是十分迅速的，因此荧光蛋白发射的是荧光而不是磷光，需要激发光源持续存在才可连续发光。但是其极快的激发响应使得荧光蛋白适合作为高灵敏度生物探针以及生物成像材料。

图三：LUYOR-3415RG激发光源照射烟草叶片的GFP发光

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