细胞光毒性试验材料与试剂

（一）光源类型

选择合适的光源必须符合的标准包括：光源发射的光波长能被受试物吸收（吸收光谱），光的剂量（在一个合理的暴露时间内能达到的剂量）能满足已知光毒性化学物质的检测。此外的波长和剂量不能有损于试验系统，如（红外区域）热量散发或类似UVB波长的高细胞毒性的干扰，因此光源要求能够稳定地释放UVA和可见光波长，推荐使用LUYOR-3450细胞光毒性辐照仪。

由于的太阳光模拟器都发射出相当数量的UVB，应经过适当的过滤使UVB＜0.1J/cm2。透过96孔组织培养板盖的光强度建议为1.7mW/cm2光强度（即5J/cm2）剂量。

（二）细胞株

选用永生化小鼠成纤维细胞系—Balb/c 3T3成纤维细胞。要求细胞来源必须是具有公信力的机构且能确保细胞品质稳定。

由于细胞对UVA的敏感性随传代数的增加可能增高，建议用于试验的Balb/c 3T3成纤维细胞传代次数好少于100次。

测试单位若自行培养细胞株，则须定期检测细胞株对UV光的敏感性，并确保无支原体污染。

（三）培养基

采用DMEM培养基、胎牛血清或小牛血清（10%）、谷氨酰胺（4mmol/L）、抗生素（青霉素和链霉素，浓度分别为100IU和100μg/mL），在36.5℃—37.5℃, 5%—7.5%CO2条件下培养。

（四）溶剂的选择

在测定前，应首先评价受试物的溶解度，以选择佳溶剂体系。溶剂必须不与受试物发生化学反应，不影响细胞活性。

能溶于水且浓度达1000μg/mL的受试物可溶于预先加温（37℃）和灭菌的磷酸盐缓冲液（EBSS或PBS）。水中溶解度有限的受试物（＜1000μg/mL）可用二甲基亚砜（DMSO）或乙醇（ETOH）等溶剂溶解。使用DMSO或ETOH作为溶剂时，其终浓度不得超过总体积的1%（v/v），阴性对照组和受试物组溶剂的体积比例应相同。

（五）受试物的配制

受试物必须在使用前新鲜配制。建议的化学物质操作和细胞处理初期都应避免受试物在光激活或光降解的光线条件下进行。

每次实验应设空白对照、溶剂对照和阳性对照。

（六）受试物剂量的设置

需通过预实验确定有光照和无光照条件下受试物的浓度范围。用溶剂将受试物原液使用同一常数稀释因子（如 ＝3.16）稀释成8个浓度，相关浓度范围应包括从大细胞毒性至几乎无细胞毒性浓度（细胞存活率在20%—的范围）。

如果预实验结果表明在浓度等于1000μg/mL时仍未出现细胞毒性，则建议高浓度为1000μg/mL；若出现细胞毒性的浓度低于1000μg/mL时，有细胞毒性的浓度少于三种，则需要进行重复试验或使用更小的稀释因子，直至出现有细胞毒性的浓度至少三种。如果根据受试物的溶解度，高浓度不能达到1000μg/mL，则以大溶解度时的浓度作为高浓度，避免受试物在任何浓度出现沉淀。

如果在无光照条件下(-Irr)受试物在高浓度时仍然不具有细胞毒性，而在有光照条件下(+Irr)出现强烈细胞毒性，则在-Irr试验和+Irr试验中可采用不同的试验浓度。

（七）中性红（Neutral Red，NR）

化学名为3-氨基一7一二甲氨基一2一甲基吩嗪盐酸盐(3-amino-7-dime-2-thylamino-2-methylphenazine hydrochloride)，CAS编号:553-24-2；或药品标准物质，编号：100460。

（八）中性红溶液

1．中性红原液。称取0.4g中性红染料，溶于100mL蒸馏水（室温条件下可保存2个月）

2．中性红使用液。在79mL DMEM培养液中加入1mL中性红原液，即为使用液。中性红终浓度为50μg/mL。

（九）中性红解吸附溶液

将蒸馏水、乙醇、乙酸按49:50:1比例配制（现用现配，储存不超过1小时）。