蛋白电泳 SDS-PAGE原理

SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。实验使用过程中，还加入DTT或者巯基乙醇，以打开蛋白间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。SDS—PAGE常采用垂直板不连续系统（分离胶与浓缩胶）。

一、样品制备

本公司有多种用于样品制备的组织裂解液，每款裂解液会配备一管蛋白酶抑制剂pmsf。本公司还有多种蛋白酶抑制剂供您使用。

• 实验试剂
• 蛋白提取
• 蛋白定量

注：本系列蛋白提取试剂所提取的蛋白由于含有去污剂，所以不适合于Bradford蛋白浓度测定试剂盒，请选择BCA法或者Lowry法。

蛋白含量测定是以标准蛋白作为对照，根据蛋白浓度不同，吸光值不同而达到定量的目的。有些方法是理解蛋白本身的吸光值（紫外光谱吸收法）来定量，但更多的是用染料对蛋白进行染色，利用染料与蛋白结合显出与原染料及蛋白不同的吸光值来定量的。后一种方法应用更普遍。蛋白定量方法的选择，应该考虑到蛋白结构（标准品选择）、蛋白溶液内干扰物等因素的影响。

二、蛋白电泳

• 实验试剂
• 预制胶
• 制胶
• 上样及电泳
• 染色

SDS-PAGE如今已形成成熟的方案，实验室可根据自己的情况和习惯来选择试剂。如选择1、2、3、4、5、6、7、8、9全部试剂可自己配制。也可以选择配制好的试剂。如10、11、12、13/14、16、9、20。还可选择10、13/14、16、9、17、18、19、20。

凝胶配制表（一）

凝胶配制表（二）

本公司的丙烯酰胺是29：1的，如需要定制其他规格的可以。 为了客户实验方便，我们生产的SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（P1200）和Tris- Tricine-SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（P1320），后者主要用于小于10kd的蛋白和多肽的分离。包含了制胶的全部试剂，方便客户操作。 如果您想节省时间，也可以使用我们的预制胶，无需配胶，直接跑电泳即可。本公司的上样缓冲液既有用于非变性的（P1017、p1027）又有变性的（P1015、P1016、P1017、P1018），有不同的稀释倍数，可以满足客户的多种实验需求。 电泳缓冲液既有用于普通的tris-甘氨酸缓冲系统的产品（T1070），又有用于Bis-tris这种系统的MOPS缓冲液（T1510） 蛋白marker有多种，非预染marker、预染marker、彩虹marker、Western Blot Marker。而且还有GE原装的变性非变性marker，广泛的分子量和用途供您选择。

跑胶后的染色可以用银染或者考染的方法，如果蛋白量少，推荐使用灵敏度高一些的银染试剂盒（G7210），否则常规染色可以使用（P1305）和（P1300），其中P1300的优点是染色时间短，半小时内即可检测到蛋白电泳条带，节省了染色脱色的时间。

三、Western blot

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分，此技术称为免疫印迹（Western blot）。Western blotting检测系统除需要过氧化物酶标记的各种二抗外，还需要配套的显色试剂。索莱宝提供DAB显色和ECL化学发光两种试剂及相应试剂盒。

• 转膜
• 显色

和PALL公司的尼龙膜和pvdf膜，具有0.22um和0.45um两种规格。 转膜后还可以用P0012（10×丽春红）检测转膜效果，尤其是针对NC膜效果更佳。 为了节省成本和时间，您可以选择本公司的SW3020（Western Blot膜再生液）对用过的膜进行清洗，随后，可以使用不同的抗体进行下一轮Western Blot实验。 膜再生液实质是在不影响膜上结合的抗原的条件下将抗体洗脱下来，实际操作中，膜类型、抗体类型、浓度及抗原特性都影响洗脱难易度。 注意：适用于 ECL和类似的化学发光试剂进行的 Western 检测。不适用于非化学发光试剂进行的 Western检测，例如DAB，NBT/BCIP。

实验操作过程中您可以针对不同的抗体选择上面合适的稀释液。