蛋白质分析技术(Western Blot、ELISA、免疫荧光与免疫组化技术)

1 原理：

将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。 

2 操作过程

SDS-PAGE电泳→转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）

封闭→一抗→洗涤→酶标二抗反应

洗涤→显色或化学发光显影

Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20mM of gossypol for 4, 8 

and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control.

Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody.

3 注意的问题

（1） 蛋白质电泳

常用SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质

非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质

Tris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。

（2）转膜

戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致

以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜15－30min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。

方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极

排去滤纸、胶和膜间的气泡。

电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置

（3）封闭

用5％脱脂奶粉或3％BSA

（含0.1％Tween20 TBS或PBS配制）

时间：室温2h或4ºC隔夜

（4）显色或显影

显色

辣根过氧化物酶：底物为DAB

碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT

化学发光显影

常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品）

注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定

（5）膜的再利用

化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping Buffer洗涤后（洗涤Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的? －2ME ）   用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3－4次。碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交

二、ELISA

1 原理：

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。 

ELISA 常用的酶和底物 

辣根过氧化物酶，底物为OPD, 深桔黄色 ，检测波长492nm

                  TMB， 蓝绿色，检测波长450nm

  碱性磷酸酶，底物为PNPP（对－消基苯磷酸酯）, 黄色 

              检测波长405nm

  ELISA各步骤的反应时间

  包被：24－36h，蛋白浓度为1－5ug/ml

  封闭：37ºC 2h 或4ºC隔夜（3％BSA）

  样本反应时间：37ºC 45min-1h

  酶标抗体反应时间： 37ºC 45min-1h

  显色时间：15min(避光）

  设对照

可以一次包被多块板，冻存备用

2 类型

（1）间接法测抗体

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体，检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。 

常用于临床血清中自身抗体的检测，以及杂交瘤上清特异性抗体的筛选。如血清中PDCD5自身抗体的检测。

(2) 双抗体夹心法测抗原

是检测抗原常用的方法。

只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。

常用的组合：单克隆抗体＋多克隆抗体

              单克隆抗体＋单克隆抗体 

后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。

用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。 

双抗体夹心法测抗原的方法：

捕获抗体包被→封闭（3％BSA）→待测抗原→洗涤（含0.1％Tween的PBS)→酶标单抗或多抗→洗涤→显色→检测

(3)竞争法测抗原

1）抗体固相测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。

其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，后的显色也愈浅。

方法：抗体包被→封闭→同时加入待测抗原和酶标抗原→洗涤→酶底物→显色→ELISA reader检测

2）抗原固相测抗原

其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，后的显色也愈浅。 

方法: 

a: 抗原包被96孔板；   b:封闭; 

c: 待测抗原与抗体反应一定时间；   d: 加入96孔板 

e: 洗涤                 f：加入酶标二抗 

g：洗涤               h：显色和检测 

（4）IgM抗体的检测 

1）间接法： 

间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定血清中的IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。 因此，如果用抗IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。 

方法：

a: 抗原包被96孔酶标板；   b:封闭; 

c: 待测血清与A蛋白反应一定时间后离心 

d:   吸取上清液加入96孔酶标板 

e: 洗涤                 f：加入酶标抗IgM的抗体 

g：洗涤               h：显色和检测 

2）捕获包被法（夹心法） 

先用抗人IgM抗体包被ELISA板，以捕获血清标本中的IgM（包括针对抗原特异性的IgM和非特异性的IgM)。然后加入相应抗原，继而加入针对抗原特异的酶标抗体，再与底物作用，颜色的深浅即与标本中的IgM含量成正相关。 

方法： 

a: 抗人IgM抗体包被96孔酶标板；   b:封闭; 

c: 加入待测血清；     d:   洗涤96孔酶标板 

e: 加入相应抗原         f：加入抗原特异的酶标抗体 

g：洗涤               h：显色和检测 

（5） ABS-ELISA技术 （Avidin Biotin system-ELISA 

原理 

亲和素是一种分子量是60，000的碱性蛋白，由四个相同亚基组成，每个亚基有一个生物素分子结合点。两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种材料所标记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入底物后，产生颜色反应。这一系统可以大大提高ELISA的灵敏度。   

操作过程： 

抗原包被→封闭→待检标本→生物素化抗体→洗涤→ 酶标记亲和素→洗涤→加底物显色和检测 

三 免疫荧光技术 

利用某些荧光素，如FITC、R-PE等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。

（一）细胞膜蛋白分子的检测

原理：

细胞膜表面的抗原或受体可特异地与相应的抗体或配体结合，将针对细胞表面抗原的抗体或配体用不同的荧光素标记，根据不同荧光物质的大激发和发射波长的不同，即可准确定量每种荧光物质的强度，从而推出相应细胞表面抗原表达量

1 直接法：细胞＋荧光素标记的抗CD分子的抗体→4ºC反应30-60min→荧光显微镜观察或流式细胞计分析。

2 间接法：细胞＋抗CD分子的抗体→4ºC 反应30-60min 荧光素标记的二抗 4ºC 反应30-60min→荧光显微镜观察或流式细胞计分析

悬浮细胞：用PBS洗二次后再做染色 

贴壁细胞：先用胰酶消化成悬浮细胞再染色 

2 Annexin V检测技术 (检测细胞凋亡的一个常规指标)

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

样本处理和染色方法

1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h）， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。 

2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。 

3 爬片细胞染色：同上，后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。 

（二）细胞内蛋白分子的检测

细胞内细胞因子的检测、凋亡相关蛋白TFAR19的检测等。

操作过程： 

（1）直接法： 

细胞→3％多聚甲醛固定和 渗透化→封闭→荧光素标记的抗体→ 洗涤→荧光显微镜观察或流式细胞计分析   

（2）间接法： 

细胞→3％多聚甲醛固定和渗透化→封闭→针对蛋白的特异抗体→洗涤→荧光素标记的二抗→洗涤 → 荧光显微镜观察或流式细胞计分析 

凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析 

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在上先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。

1 悬浮细胞的染色：

（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1×106），PBS洗2次， 

（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，

（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。

（5）加入 FITC标记的TFAR19单抗，4°C反应30min

（6）荧光细胞洗液洗2次，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。

2：贴壁细胞的原位染色

（1） 贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。

（2） 将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。

（3） 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ul）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。

四免疫组织化学技术

原理：

是指酶标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的成色反应，对相应的抗原进行定性、定位和定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙的结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜等）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等），并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。

免疫组化染色技术的分类

免疫荧光法（Immunofluorescence technique）

免疫酶法（Immunoperoxidase technique）

免疫金银法（（Immunogold technique）

ABC法（ Avidin-Biotin Complex）

五 蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术

1 GST融合蛋白进行Pulldow实验 

  （1）原理

  细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。

  两种应用：

  1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用

  2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用   

（2）方法：

  1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白）

  2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4ºC 2h

  3）离心弃上清

  4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心

  5）取上清进行SDS-PAGE电泳，

  6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白

该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行

2 免疫共沉淀

（1）原理

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档

缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用

免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题

（2）方法

1) 收获培养的细胞（1×107－1×108）冷PBS洗涤2次

2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min

3) 12000rpm   离心 30min

4）收集上清并加入适量抗体，4ºC摇动1h

5）加入ProteinG-Sepharose悬液， 4ºC摇动1h

6）细胞裂解液洗涤ProteinG-Sepharose混合液

7）离心弃上清

8）沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5－10min

9）离心，上清液跑SDS-PAGE 胶

10）考马氏亮兰染色、银染

    Western Blot     质谱分析

（3）注意的问题

1）细胞裂解

采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质

  相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。

  不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。

2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用

3）使用对照抗体：

      单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗

      兔多克隆抗体：正常兔IgG

3 酵母双杂交系统 

（1）原理：

将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。 

1）已知蛋白之间相互作用的检测：

2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；

3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。

4 蛋白质芯片

其制作原理类似于基因芯片，所不同的是，蛋白、多肽芯片所用的样品是提纯的蛋白、多肽。其检测的原理类似于抗原、抗体检测的ELISA法。如采用双抗夹心的形式，可通过机械点涂的方法，将多种不同的单克隆抗体点样固定在固相介质表面，如PVDF膜上，制备成抗体蛋白芯片，与制备的多种抗原样本杂交、结合，芯片上的抗体捕获相应的抗原，然后再与标记的多种不同的抗体杂交，由于抗原具有多价结合表位而结合标记抗体，根据杂交信号的有无、多少而进行定性、定量的分析。 

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