线粒体膜电位检测试剂盒操作规程

　　1、JC-1染色工作液的配制：

　　a、取100μL 10×染色结合液加900μL灭菌双蒸水稀释成1× 染色结合液，混匀并预热37℃；

　　b、吸取500μL  1×染色结合液，加入1μL JC-1，剧烈Vortex充分溶解，混匀配成JC-1工作液；

　　c、因JC-1在水中的溶解度很小，所以可以通过离心的方法（10，000rpm，1min）去除不溶的颗粒，吸取离心后的上清使用，以消除干扰。离心后的上清为JC-1工作液

　　2、用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组和阳性对照组【用适当的凋亡诱导剂，诱导适当时间后经其它检测（如AnnexinV或 Caspase 3活性）证实确有凋亡产生】，收集细胞；

　　3、用PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min），收集不多于1×106的细胞；

　　4、取500μL JC-1工作液将细胞均匀悬浮，37℃，5%CO2的培养箱中孵育15~20min；

　　5、室温离心（2000rpm，5min）收集细胞，用500μL 1×染色结合液洗涤两次；

　　6、吸取500μL  1× Incubation Buffer重新悬浮细胞；

　　7、荧光显微镜观察或流式细胞仪分析。

　　A、荧光显微镜观察

　　1.滴一滴上述细胞悬液于载玻片，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察；

　　2.对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；用PBS洗涤细胞两次；

　　滴加100μL JC-1工作液，加盖玻片，37℃，5%CO2的培养箱中孵育15~20min；1×染色结合液洗涤1~2遍；将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察；

　　线粒体膜电位检测试剂盒注意事项：

　　1、JC-1在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻全部融解后使用。

　　2、对PH变化过于敏感的细胞建议用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗涤，或延长观测时间。

　　3、流式细胞仪检测线粒体膜电位变化受到多种因素的影响，因诱导剂、细胞株类型，作用时间的不同而荧光强度比例都有不同，因此没有通用标准的补偿设门指南，因此每个试验需设阴性及阳性对照组进行荧光补偿及设门。

　　4、加入JC-1并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测。

　　5、组织需先制备单细胞悬液或提取纯化线粒体后方可进行检测。

　　6、如果发现染色结合缓冲液中有沉淀，必须全部溶解后才能使用。

　　7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。