多光子激光扫描显微镜（Multiphoton Laser Scanning Microscopy，简称MPLSM）是一种先进的光学显微技术，它利用两个或多个光子同时被样品吸收的非线性光学过程来激发荧光，从而实现对生物样品深层结构的高分辨率成像。与传统的光学显微镜相比，多光子显微镜具有更深的穿透力、更少的光毒性以及更高的空间分辨率等优点，特别适用于活体细胞和组织的长时间观察。

原理

多光子显微镜的核心原理是多光子吸收。在传统的单光子激发中，一个高能量的光子被荧光分子吸收，激发荧光。而在多光子吸收中，两个或多个低能量的光子几乎同时被同一个荧光分子吸收，其总能量相当于一个高能量光子的能量，从而激发荧光。这一过程通常发生在激光聚焦点处，因此具有很高的空间选择性。

关键组件

多光子显微镜的关键组件包括：

激光器：通常使用飞秒脉冲激光器，因为其短脉冲宽度可以提供高能量密度，有利于多光子吸收过程。

扫描系统：包括扫描镜和光路系统，用于控制激光束在样品上的扫描路径。

探测器：用于收集样品发出的荧光信号，并将其转换为电信号，最后形成图像。

光学元件：如物镜、分光器等，用于聚焦激光和收集荧光。

优势

多光子显微镜相较于其他显微技术具有以下优势：

深层成像能力：由于使用的是红外光，其散射和吸收较小，因此可以实现对样品较深层结构的成像。

减少光毒性：由于激发仅限于激光聚焦点，减少了对样品的光损伤和光毒性，适合长时间观察活体细胞。

提高分辨率：多光子激发的荧光仅在焦点处产生，因此具有天然的光学切片能力，可以实现三维成像。

减少背景信号：由于激发仅限于焦点处，因此背景信号较低，提高了图像的对比度。

应用

多光子显微镜在生物医学研究领域有着广泛的应用：

神经科学：用于观察活体大脑中的神经元活动和神经网络。

肿瘤学：研究肿瘤微环境和血管新生。

发育生物学：观察胚胎发育过程中的细胞动态。

免疫学：研究免疫细胞在组织中的行为。

结论

多光子激光扫描显微镜是一种强大的成像工具，它通过多光子吸收原理，克服了传统显微镜的局限性，为生物医学研究提供了新的视角。其在深层成像、减少光毒性、提高分辨率等方面的优势，使其成为研究活体组织和细胞的技术之一。随着技术的不断发展和优化，多光子显微镜将在未来的科学研究中发挥更加重要的作用。