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如何提取Insphero 三维(3D)微组织中的RNA?

时间:2015-04-29      阅读:2492

很多老师使用瑞士insphero 的3D悬滴培养板获得3D微组织后,要提取RNA进行荧光定量PCR。下面这篇文章就是介绍如何提取insphero 3D微组织中的RNA:


使用Promega ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System提取三维(3D)微组织的RNA


Introduction介绍

基于细胞的药物开发和毒理学的多项分析,从培养细胞中提取高质量的RNA是非常重要的。一些应用如实时荧光定量PCR或微阵列分析的前提都是需RNA提取步骤。下面介绍的是从很小的微组织(约1000个细胞)中提取总RNA的protocol(ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System, promega)。

若想使用自动化RNA提取方法:可使用Promega的Maxwell 16 System。


Summary概述

从3D Insight 人肝脏微组织中提取RNA(ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System)。提取的RNA样本用QuantiFluor RNA system,Agilent 2100 Bioanalyzer,GoTaq 1-Step RT-qPCR System进行分析。


Materials材料

3D Insight Microtissues in GravityTRAP(Insphero)
1×PBS,含钙离子和镁离子
ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System(Promega Z6110)
Quantus Fluorometer(Promega E6150)
QuantiFluor RNA system(Promega E3310)


Procedure操作流程


一、微组织的准备


1.轻柔的吸除GraityTRAP板中的培养基,用70ul的1×PBS洗涤微组织2次,如下图Figure 1:

Figure 1: Pipette tip positioning during aspiration and addition of PBS


注:轻柔、缓慢洗涤微组织(<30ul/秒)


2.转移微组织,1000ul吸头垂直覆盖GraityTRAP板孔的底端,吸头要与孔底部紧密接触,如Figure 2,将微组织吸出(约50ul)转移到1.5ml离心管中,避免吸入气泡(避免微组织损失)。

Figure 2: Microtissue harvest from GravityTRAP plate using a 1000ul pipette tip


3. 4000g离心1min,去除PBS,直接作为RNA提取的样本


二、RNA提取—ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System

1.直接加250ul LBA+TG buffer到样本中

2.漩涡震荡10秒,用吸头吹打10次,裂解微组织。如想更*裂解,可使用掌上均质器5-10秒

3.再加85ul的isopropanol(异丙醇),漩涡震荡5秒混合均匀

4.再参照ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System的手册进行结合和洗脱等步骤

5.用30ul水洗提RNA后,冰上放置

6.RNA浓度和产量用QuantiFluor RNA system和Quantus Fluorometer检测


Typical Results结果

使用ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System提取3D InSight人肝脏微组织中的RNA,结果见Figure 3.

Figure 3:A-RNAs were isolated from either 1,2,4,or 8 microtissues. Yields were determined using the QuantiFluor RNA system with the Quantus Fluorometer and the RNA 6000 Pico kit. All values are greater than 9 indicating high quality RNA. 

B-HPRT specific primers were used with the GoTaq 1-Step RT-qPCR System to show amplifiability of the isolated RNAs.

C-RNAs were isolated from single microtissues to compare the average yield from one microtissue using this purification system.The line represents the average yield(n=6).


原文章链接:

http://www.qbioscience。。com/FileUPLoad/DownLoadFile/635659149543906250.pdf

Insphero 三维细胞培养产品链接:

http://www.qbioscience。。com/products_T304.html


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