废液抽吸与细胞培养|流程与方法
时间：2024-06-25 阅读：790
什么是废液抽吸?
废液抽吸(aspiration/suction)为现代生物学技术中常用的技术，用以移除废弃液体。生物学中常见的细胞培养，是将真核或原核细胞培养于适宜的培养液(culture medium)及环境中，使其在受控制的状态下生长(growth)及增殖(proliferation)的过程。细胞培养的流程包含解冻细胞、培养(cell culture)、继代培养(俗称分盘，cell subculture)及冷冻细胞等步骤。
然而，细胞生长过程中会产生代谢物、细胞碎片等废弃物影响细胞健康，甚至导致细胞凋亡。因此在细胞培养过程中，需定期更换培养液，而移除旧有培养液、洗涤液的行为，则为废液抽吸。
真空废液抽吸装置(suction system,aspiration system)常见如上图，主要包含：
真空瓶(vacuum flask)
缓冲瓶(safety bottle)
过滤器(filter)
真空源(vacuum source)
连接并启动真空源后，细胞培养瓶/皿中的废液会因压力差而被抽吸、收集至真空瓶，缓冲瓶则做为防溢装置使用，以避免废液被抽吸至真空源内。过滤器可使用HEPA滤膜(High Efficiency Particulate Air filter或0.22µm过滤器，以过滤掉废液及空气中的粒子、确保抽吸效率。
细胞培养流程
▲细胞培养前，请确认操作环境符合无菌操作条件，且应避免和细菌实验共用设备，以防污染。
解冻细胞(thawing cells)：将冷冻细胞以37 oC快速解冻、回温，以避免细胞损伤。
培养(cell culture)：依据细胞种类和浓度，将细胞和培养基均匀混合后，放入培养箱中培养。
继代培养(cell subculture)：当细胞生长至一定程度后，收集细胞，分殖于新的培养基中。
进行继代培养时，其依细胞种类不同，处理方式可分为以下两大类：
a.附着型细胞(adherent cell)，又称贴壁培养、单层培养(monolayer culture)
去除旧培养基废液
以Phosphate buffered saline(PBS)洗涤细胞一至二次
加入trypsin-EDTA溶液，于37 oC下作用2~20分钟，使细胞可自培养瓶/皿中脱落
加入含有血清的新鲜培养基中，以终止胰蛋白酶作用
将脱落的细胞及其团块打散、混合均匀后，收集所有液体
离心后移除上清液，并添加新鲜培养基，依稀释比例转移至新的培养瓶/皿中进行培养
b.悬浮型细胞(suspension cell)，又称悬浮培养(suspension culture)
将细胞培养液以1000 rpm离心5分钟后，吸除上清液
加入适量新鲜培养基，与沉淀细胞混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶/皿中进行培养。
冷冻细胞(cryopreservation)：获得目标细胞株后，将细胞悬浮于含有5~10%DMSO(二甲基亚砜，dimethyl sulfoxide)及30~50%FBS(胎牛血清，Fetal Bovine Serum)的新鲜培养液中，以-80 oC或液态氮等低温设备保存。
细胞计数(cell counting)：用以计算细胞浓度，可利用传统血球计数器(Neubauer chamber)或自动计数器，计算细胞浓度可用来判断目前细胞生长的情况。
废液抽吸方法的比较
废液抽吸目前有多种方法可以进行。早期实验室多利用移液器(pipette)或电动吸管抽吸废液，然而因为需要重覆抽吸及排除液体，长时间使用下来易造成手部不适及疲劳。除此之外，电动吸管须搭配无菌刻度吸管使用，而现多使用抛弃式吸管排除污染疑虑，因此一次实验下来通常会产生大量废弃物，造成环境负担。
现代实验室则普遍会自行购置真空帮浦搭配真空瓶自行组装，如此会较电动吸管有效率，且设备取得较容易，然而自组式系统常见许多例如：管线配置不良，造成工作环境混乱、或是玻璃吸管经常破裂等安全性上的缺点。
Lafil废液抽吸系统及BioDolphin废液抽吸套件主要为生命科学细胞培养或实验过程中溶液抽吸应用，可直接放置于无菌无尘操作台(laminar flow)使用。Lafil废液抽吸系统整合真空源、真空瓶与废液抽吸套件，提供实验室一体化解决方案，更比传统废液抽吸系统减少一半檯面占用面积，并使用围篱式平台固定真空瓶，避免操作者不小心碰触瓶身而倾倒。
洛科Lafil废液抽吸系统及BioDolphin废液抽吸套件
實驗室電動吸管 | 自組真空抽吸系統 | 洛科廢液抽吸系統 | ||
Lafil 100 | Lafil 200 | |||
整合式設計 | 是，單一產品 | 否 | 是，一體化all-in-one設計 | |
抽吸耗材 | 無菌刻度吸管 | 吸管尖 (tip) | 吸管尖 (tip) | |
長時間操作 | 易造成手部肌肉疲勞 | 易造成手部肌肉疲勞 | 符合人體工學、單手退tip設計 | |
吸力調節 | 無 | 有 | 無 | 有 |
廢液清除 | 每次抽吸排淨 | 吸取至真空瓶滿後清除 | 吸取至真空瓶滿後清除 | |
真空瓶 | 無 | 通常為 1 L 抽氣瓶 | 1 L PP瓶 | 4 L PP瓶 |
幫浦/設備保護 | 無 | 無 | 有 | |
廢液溢漏危險 | 無 | 高風險 | 無 | |
置入無菌操作台 | 可 | 不可 | 可 | 不可 |
空間利用性 | 體積小 | 管路雜亂佔空間 | 可省去自組系統50~65%空間 | |
環境友善 | 易產生大量拋棄式廢棄物 | 易產生大量拋棄式廢棄物 | 所有配件採用耐高溫高壓滅菌材質，另有節能安靜的eco機種 | |
特殊需求 | 無 | 無 | Lafil 200：支援2人同時抽吸 | |
细胞培养实验室基础设备
無菌操作台，或生物安全櫃 | 無菌操作台可作為實驗室內的無菌工作區，同時也可遏止各種於微生物實驗程序中可能產生的傳染性飛濺物或氣膠。 |
培養箱 | 使用培養箱的目的是為細胞生長提供舒適的環境。培養箱可透過控制溫度、濕度和二氧化碳濃度提供細胞適合的生長條件。 |
廢液抽吸系統 | 使用廢液抽吸系統，可以更輕鬆地從細胞培養容器中吸除培養基和試劑。 |
光學顯微鏡 | 光學顯微鏡是細胞培養工具，如正立顯微鏡、倒立顯微鏡。其將細胞可視化，以監測細胞生長情形、細胞形態、計數與識別污染物質。 |
低溫儲存設備 | 隨著傳代次數的增加，連續培養的細胞可能會出現遺傳不穩定性，如遺傳漂變、哀老； 因此將它們保存在低溫儲存設備中以供長期儲存是細胞培養中重要的步驟。 |
水浴器 | 細胞實驗室普遍會將水浴槽設置為37 oC，用於預熱培養基以及解凍冷凍細胞或試劑等。 |
废液处理与废弃办法
含有危险化学品（如氯）之有机废液应收集至设有适当标示之专用废液桶，不含危险化学品之其它废液可一併收集于一般混合废液桶，废油则需收集于废油桶中。细胞培养用的废液应加入适当浓度的消毒剂，如漂白水(次氯酸钠Sodium Hypochlorite)，使细胞致死，再倒入水槽或废液桶。培养皿等生物医疗相关废弃物则应置于生物医疗废弃物袋中，进行高温高压灭菌后以一般废弃物丢弃，或是请依照我国生物医疗废弃物相关规定处理。
参考资料
Cell Culture Basics:Equipment,Fundamentals and Protocols|Technology Networks
Cell Culture Basics,EU(vanderbilt.edu)
Cell Culture Fundamentals:Safety Aspects of Cell Culture,Sigma-Aldrich
Cell culture protocol,Proteintech
Cell culture|细胞培养，ACE Biolabs
Laboratory Environmental Sample Disposal Information Document,Section 6.0,2010,US EPA
TISSUE CULTURE WASTE DISPOSAL GUIDELINES,2017,Laboratory Safety,THE GEORGE WASHINGTON UNIVERSITY
Tissue Culture Waste Disposal Guide,2022,EHS,Weill Cornell Medicine
行政院环境保护署，事业废弃物贮存清除处理方法及设施标准，环署循字第1111016706号
细胞继代培养，生物资源保存及研究中心-BCRC小教室