正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

规格：分光光度法 50 管/48 样

测定意义

SDH（EC 1.3.5.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。SDH 是线粒体的一种标志酶，位于线粒体内膜上的一种膜结合酶，是连接呼吸电子传递和氧化磷酸化的枢纽之一。此外，为多种原核细胞产能的呼吸链提供电子。

测定原理

SDH 催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原 2,6- 二氯酚靛酚（DCPIP），并且在 600nm 处具有特征吸收峰，通过 600nm 吸光度的变化，测定 2．6-DPIP 的还原速度，代表 SDH 酶活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：50mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂二：10mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂三：1mL×1 支，-20℃保存； 试剂四：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1 支，4℃保存，临用前加入 2mL 蒸馏水，用不完的试剂仍 4℃保存； 试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 2mL 蒸馏水，用不完的试剂 4℃保存。

样本的前处理

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。

3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 SDH（此步可选做）。

在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W， 超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 SDH 活性测定。

测定步骤和加样表

用蒸馏水调零后，依次加各试剂到 1 mL 玻璃比色皿中，在加入试剂六的同时开始计时，混匀，在 600 nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1 和 1 分 20 秒时的吸光度 A2，计算ΔA=A1-A2。

SDH 活性的计算

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。SDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 样) ÷T=1508×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH 活性（nmol/min/g  鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T=304.6×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。SDH 活性（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.609×ΔA V 反总：反应体系总体积，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴ L / mol /cm； d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL； T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。