荧光免疫分析浅谈

     1950年coons合成异硫氰酸盐（荧光染料），用作标记抗体做小鼠组织切片染色，开创了免疫荧光技术（Immunofluorescence technique)，又称为荧光抗体技术（Fluorescent antibody technique).由于浆抗原,抗体的反应特异性与荧光的敏感性结合起来，因此，广泛应用于医学,生物学,分子生物学,生物化学,免疫学等领域，它分为创痛的免疫荧光技术和现代免疫荧光技术。

传统的免疫荧光技术用异硫氰酸荧光黄（FITC),罗丹明标记特异抗体，对组织切片,细胞细菌,病毒和液体物质作固相荧光染色，荧光显微镜下分析荧光状态,分布。该技术及流式细胞仪和荧光偏振分析从至今仍广泛用于临床诊断和基础研究。

现代荧光技术的应用发展十分广泛，如蛋白质,DNA，细胞膜受体，细胞内物质，复合抗体，亚细胞分子的标记等。仪器*。如荧光激活细胞分类仪(FACS)，单克隆荧光技术电子计算机图像显示仪，荧光自动化分析测试仪。现代荧光免疫技术在标记与探测上，稀土元素Eu配合物抗体标记Eu（TIFA)的灵敏度。此外，还有竞争性可磁性固相荧光，双位点免疫荧光等。20世纪80年代在普通荧光标记基础上发展的新技术—时间分辨荧光技术（TRFIA)是以稀土离子标记抗原或抗体，建立的细胞，核酸探针新技术。

将荧光法引入免疫分析主要是因为它与分光光度法相比具有高的灵敏度，其灵敏度是分光光度法10—1000倍。人们寻找单分子检测的工作几乎都围绕着荧光化合物，这本身就反映了荧光法在提高分析灵敏度方面的潜力。另外，荧光测定可以把荧光激发波长，荧光发射波长，荧光寿命，偏振等参数同时结合起来，形成特异而花样繁多的分析系统。

荧光免疫分析的原理：

免疫荧光技术是以荧光素标记抗体（或抗原),利用被检物质在反应体系中特异结合位点荧光的强弱，有荧光显微镜,流式细胞分析仪和自动化电子成像计算机进行定性,定量分析的技术。通常用荧光素表及抗体,称为荧光抗体技术:其次是荧光素标记抗原，称为荧光抗原技术。荧光素是具有共轭双键体系结构的化合物，当接受紫外光等照射时，由低能量级的基态向高能级跃迁，形成电子能量较高的激发态。当垫子从激发态恢复支基态时，发出荧光

荧光标记抗体

一 FITC标记法（透析袋内渗透标记）

1将FITC溶于0.5mol/L，PH=9.2的碳酸盐缓冲液中，使用FITC的zui终浓度为8-10mg/ml、2 将带标记的抗体装入透析袋内，4度条件下用0.15mol/L，氯化钠溶液透析2D，期间换液3次。然后改用0.05mol/L，PH=8.5的碳酸盐缓冲生理盐水继续透析4-5Hzui后，自用0.05mol/K.PH=9.2的碳酸盐缓冲生理盐水透析2h

3将该透析袋置于上述FITC溶液中透析，使用荧光素与抗体IgG结合。FITC的zui终浓度是0.1mg/ml。体积是透析袋IgG溶液体积的10倍。在4度条件下，透析14-16H

标记抗体的纯化

   纯化的母的在于消除未结合的游离荧光素和结合荧光素过多的抗体。

将荧光素标记的抗体装入透析袋中，先用流水透析10秒。然后用0.01mol/LPH=7.1的磷酸盐缓冲液或生理盐水透析一周时间期间每天换液3次，直到外透析液在紫光灯下发射硬广为止。