ATP 含量试剂盒说明书

测定意义：

ATP 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物能量通货，能荷是描述细胞能量 代谢状态的主要参数。测定 ATP 含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。

测定原理：

ATP 在 254 nm 下有吸收峰，可以利用液相色谱法测定其含量。

需自备的实验用品：

液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器（水系，50 个，0.22μm）、滤 膜（水系和有机系各 1 个，0.45μm）、C18 柱（4.6 ×150 mm）、可调式移液器、样品瓶（50 个，2mL）、甲醇（色谱级，300 mL）和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存； 

试剂二：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂 1×1 瓶，粉剂 2×1 瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂 1 和粉剂 2 溶解 后倒入 1000mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 1000mL，形成流动相缓冲液基质（注：试剂瓶 中的粉剂要冲洗干净）, 4℃可保存 1 周；

试剂四：ATP 标准品 5mg×1 支，-20℃保存。临用前加入 1mL 蒸馏水，配成 5mg/mL 溶液， 配好后-20℃可保存 1 周.

实验前的准备工作：

1、将蒸馏水 1000 mL、流动相缓冲液基质 1000 mL 和甲醇 300 mL 用 0.45 μm 的滤膜抽滤， 以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：蒸馏水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤，甲醇 用有机系滤膜抽滤）。

2、流动相的配制：将抽滤完毕的流动相缓冲液基质 1000 mL 与甲醇配比为 99.9：0.1（v/v）， 即取 999mL 缓冲液基质与 1mL 甲醇混合。

3、将抽滤完毕的甲醇和蒸馏水配比成 100%的甲醇， 10%的甲醇，蒸馏水各 250 mL。 将 2 和 3 中的溶剂超声 30 分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。

ATP 的提取：

1、组织的处理：准确称取组织重量 0.1g，加入 1mL 试剂一，提取 ATP， 4000g 常温离心 15 min，取上清液，加入等体积的试剂二，混匀，4000 g 常温离心 15 min，取上清，0.22μm 水系微孔滤膜过滤后冰上放置，待测。

2、细胞处理：收集约 30 mL 细胞，离心菌体经干燥后，加入 1 mL 试剂一，超声破壁细胞(950 W，30%，15 min，工作 1 s 间隔 2 s)，4000 g 常温离心 15 min，取上清液，加入等体积的 试剂二，混匀，4000 g 常温离心 15 min，取上清，0.22μm 水系微孔滤膜过滤后冰上放置， 待测。

ATP 含量测定操作步骤：

1. 开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开 empower 软件，在方法组中设置进样量 20 μL，流速 1 mL/min，保留时间 10min，检测波长 254nm,设置完毕保存方法组。 
2. 用100%的甲醇、10%的甲醇、蒸馏水按甲醇浓度从大到小的顺序洗色谱柱 30min。 
3. 用流动相洗柱子，待基线稳定后开始加样。 
4. 加入标准品 20 μL，在 10min 内可分离 ATP， ATP 的保留时间在 3min 左右，（柱子不同， 保留时间有差异），计算不同浓度的 ATP 标准品的峰面积。 
5. 加入样品 20 μL，在相应保留时间处检测 ATP 的峰面积。

ATP 含量的计算：

将5mg/ml 的 ATP 标准品用蒸馏水分别稀释成 100 μg/ml、80 μg/ml、60 μg /ml、40 μg /ml和20 μg /ml 的 ATP 标准品溶液，以标准品浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标分别计 算 ATP 标准曲线。

   来源于青岛捷世康：www.jisskang。。ｃｏｍ

注：标准品的稀释倍数要根据样品中 ATP 浓度确定，样品中 ATP 的峰面积必须落在不同浓 度的 ATP 标准品的峰面积之内，该标准品稀释倍数只是一个参考。