氨基酸的分离与鉴定——双向层析法

目的要求

（1）、学习双向纸层析的原理。

（2）、掌握纸层析法分离混合氨基酸的操作方法。

实验原理

   纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后某一物质在纸层析谱上的位置常用比移植Rf来表示。

Rf=原点至纸层析斑点中心点的距离→原点至溶剂前沿的距离

    纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、pH、温度）下，各物质有固定的Rf值，据此可达到分析鉴定的目的。

    由于滤纸纤维可吸收20%～25%的水分，且其中6%～7%以氢键形式与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去。所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶剂作流动相。

    纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。

（1）、被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.05～0.8之间，且各组分之Rf值相差能大于0.05，以免斑点重叠。

（2）、溶剂系统中任一组分与被分离物之间不能起化学反应。

（3）、被分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整。

    本实验采用八中混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱。

试剂和器材

1）、试剂

0.1%（w/v）茚三酮丙酮液。

溶剂系统：*相：正丁醇：88%甲酸：水=15:3:2（V/V）。

          第二相：正丁醇：呲啶：98%乙醇：水=5:1:1:1（V/V）。

2）、测试样品

    标准氨基酸混合溶液：亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各100mg溶于50mL0.01ml/L盐酸中。

3）、器材

    层析缸25cm×40cm（×2）；培养皿15cm（×2）；喷雾器；毛细管内径0.1cm；电吹风；烘箱；层析滤纸12cm×12cm；铅笔，尺。

操作方法

1）、点样

    取层析滤纸一张（12cm×12cm），在距纸边1.2cm处划一基线，再将纸转90度，距纸边1.2cm处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液，点与两线交点处，点的直径控制在2mm左右，不可过大。待样品干燥后再点一次。滤纸上点样斑点干燥后，把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铬丝相连，但不可重叠相碰。

2）、展层

    在层析缸中平稳的放入装有*相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入，点样一段接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开，约2h后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸，悬挂于室温中，用电吹风充分吹近溶剂。然后载去未走过溶剂的滤纸边缘，将滤纸转90度，卷成如前圆筒状，放入盛第二相溶剂的层析缸内展开，约1h后溶剂展开到距纸边0.5cm时取出，用电吹风吹近溶剂使其干燥。

3）、显色

    用喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上，然后悬滤纸于65℃烘箱内，烘30min，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出。用直尺量出各斑点中心与原点的距离以及溶剂前沿与原点的距离，求出各氨基酸的Rf值。将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，可得知该斑点的准确成分。

注意事项

（1）、烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。

（2）、*相溶剂在使用前再按比例混合，否则会引起酯化，影响层析效果。

（3）、整个实验操作应戴手套进行。