免疫技术用荧光染料

    在流式细胞计的应用中，荧光色素是关键试剂，免疫荧光的检测，对试剂的要求尤其具有特殊性。

     对荧光染料的要求1、染料必须在理想的激光光源的某一波长有强烈吸收；2、由于免疫荧光测定，信号的强度是主要限制因素，故要求染料应有较高的量子效应3、激发光和发射光之间要有较大的波长区别，以便使荧光能与激发光源所造成的背景区别开来4、便于同抗体和其他蛋白偶联，又不影响其荧光及抗体的特异性。

荧光染料  常见者见表。其中FITC已为国内免疫界通用，此外不做介绍。当前国内常用的商品化的染料类是藻胆蛋白（Ohycobili protein）是来自光合青色细菌（photosyntheric  cyanobacteria）和红色藻类（Red algae）的自然荧光色素。其基本类型为：藻红蛋白（Phycoerythrin，PE）、藻青蛋白（Phycocyanin）及别藻青蛋白（Allophycocyanin，APC),其分子结构基本是几个带有开链四吡咯色基因的多肽混合物，很适合标记抗体，它们有以下特点：可以在广泛的波长下有效地激发；每个分子都带有许多产生高激发系数的发光色基团；激发光、发射光易鉴别（Stokes位移大）；易溶于水，发出的荧光不受pH影响，因而不易受生物因素影响而淬灭。这类荧光色素的代表是藻红蛋白。目前，尽管应用者较多，但其标记困难及结合物易形成素脱落，保存时间短等缺点，也影响其推广，人们正在寻找新的荧光染料。为了测定细胞表面的多种标记，还应考虑免疫荧光染料反光源和这些颜料的相互配合的要求；1、两种以上抗体同两种以上色素交联，该色素可被单波长光激发，并能通过特殊的发射光区别开；或用不同激发波长来激发，发射光可通过光谱的差异、特殊发射光或发射时间不同来区别。2、结合抗体的色素不干扰抗体反应的特异性，或同一实验中其他色素的特性。3、适用一步、二步、三步染色法，加适当对照组能克服试剂间的干扰。

    为了测定细胞表面的多种标记，还应考虑免疫荧光染料反光源和这些颜料的相互配合的要求；1、两种以上抗体同两种以上色素交联，该色素可被单波长光激发，并能通过特殊的发射光区别开；或用不同激发波长来激发，发射光可通过光谱的差异、特殊发射光或发射时间不同来区别。2、结合抗体的色素不干扰抗体反应的特异性，或同一实验中其他色素的特性。3、适用一步、二步、三步染色法，加适当对照组能克服试剂间的干扰。