0400 光谱法

光谱法（spectrometry）是基于物质与电磁福射作用时，测量由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度进行分析的方法。按不同的分类方式，光谱法可分为发射光谱法、吸收光谱法、散射光谱法；或分为原子光谱法和分子光谱法；或分为能级谱，电子、振动、转动光谱，电子自旋及核自旋谱等。 质谱法（mass spectrometry，MS）是在离子源中将分子解离成气态离子，测定生成离子的质量和强度（质谱），进行定性和定量分析的一种常用谱学分析方法。严格地讲，质谱法不属于光谱法范畴，但基于其谱图表达的特征性与光谱法类似，故通常将其与光谱法归为一类。 分光光度法是光谱法的重要组成部分，是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。常用的技术包括紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、荧光分光光度法和原子吸收分光光度法等。可见光区的分光光度法在早期被称为比色法。 光散射法是测量由于溶液亚微观的光学密度不均一产生的散射光，这种方法在测量具有1000到数亿分子量的多分散体系的平均分子量方面有重要作用。拉曼光谱法是一种非弹性光散射法，是指被测样品在强烈的单色光（通常是激光）照射下光发生散射时，分析被测样品发出的散射光频率位移的方法。上述这些方法所用的波长范围包括从紫外光区至红外光区。为了叙述方便，光谱范围大致分成紫外区（190～400nm），可见区（400～760nm），近红外区（760～2500nm），红外区（2.5～40μm或4000～250cm^-1）。所用仪器为紫外分光光度计、可见分光光度计（或比色计）、近红外分光光度计、红外分光光度计、荧光分光光度计或原子吸收分光光度计，以及光散射计和拉曼光谱仪。为保证测量的精密度和准确度，所用仪器应按照国家计量检定规程或药典通则中各光谱法的相应规定，定期进行校正检定。 原理和术语 单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定的浓度范围内被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系可以用朗伯-比尔定律表述如下： A=1g（1/T）= Ecl 式中 A为吸光度； T为透光率； E为吸收系数，常用的表示方法（），其物理意义为当溶液浓度为1%（g/ml），液层厚度为1cm时的吸光度数值； c为100ml溶液中所含物质的重量（按干燥品或无水物计算），g； l为液层厚度，cm。 上述公式中吸收系数也可以摩尔吸收系数ε来表示，其物理意义为溶液浓度c为1mol/L和液层厚度为1cm时的吸光度数值。在大吸收波长处摩尔吸收系数表示为εmax。 物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。在一定条件下，物质的吸收系数是恒定的，且与入射光的强度、吸收池厚度及样品浓度无关。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称之为比色分析。 化学因素或仪器变化可引起朗伯-比尔定律的偏离。由于溶质间或溶质与溶剂的缔合及溶质解离等引起溶质浓度改变，将产生明显的朗伯-比尔定律偏离。非单色入射光、狭缝宽度效应和杂散光等仪器因素都会造成朗伯-比尔定律的偏离。 原子吸收过程基本上遵从朗伯-比尔定律，吸光度与待测元素的原子数目呈正比关系。据此，可建立标准曲线并根据溶液的吸收值计算溶液中元素的浓度。 荧光发射光谱是经光照射的活性物质的发射光分布光谱图，它以被激发物质发射光的强度为纵坐标，以发射光的波长为横坐标。荧光激发光谱是激发光分布光谱图，它以被激发物质发射光的强度为纵坐标，以入射（激发）光波长为横坐标。如同在吸收光谱中一样，有机化合物荧光所覆盖的电磁波光谱重要的区域包括紫外区、可见区和近红外区等，在250～800nm范围。当分子吸收光辐射后，能量以热能的方式消散或以与吸收波长相同或更长的光辐射释放。光的吸收和发射都是由于电子在分子不同能级间、不同轨道间发生跃迁造成的。在光的吸收和发射间存在时间延迟，对于大多数有机荧光化合物溶液，这一时间间隔也就是分子位于激发态的时间，大约为10^-9～10^-8秒。荧光的寿命很短，可与磷光相区别，后者的寿命一般为10^-3秒到几分钟。 拉曼散射活性是一种分子特性（单位cm⁴/g），它决定随机取向样品中所观察的拉曼谱带强度。拉曼散射活性由产生的分子极化所决定，极化使分子运动而产生拉曼位移谱带。一般，拉曼谱带的强度与样品的浓度呈正比关系。 当各论正文品种中给出红外光谱或拉曼光谱数据时，字母S、M、W分别代表强峰、中等强度峰和弱峰；sh为肩峰，bd为宽峰，v表示非常的意思。 各光谱法相对适用性 对于多数药物，紫外-可见光谱法定量测量的准确度和灵敏度要比近红外和红外光谱法高。物质的紫外-可见光谱通常专属性差，但是很适合作定量分析，对于大多数物质也是有用的辅助鉴别方法。近年来，近红外光谱法的应用日益广泛，特别是在大量样品的快速鉴别和水分测定方面。近红外光谱特别适合测定羟基和氨基，例如乙醇中的水分，氨基存在时的羟基，碳氢化合物中的乙醇，以及叔胺存在时的伯胺和仲胺等。 在不含光学异构体的情况下，任何一个化合物都有一个特定红外光谱，光学异构体具有相同的红外光谱。但是，某些化合物在固态时会表现出多晶型，多晶型会导致红外光谱的差异。通常，结构中微小的差别会使红外光谱有很明显的差别。在红外光谱中呈现大量的吸收峰，有时不需进行预先分离，也可以定量测定成分已知的混合物中的某个特定成分。 拉曼和红外光谱对于不同的官能团具有不同的相对灵敏度，例如，拉曼光谱对碳硫键和碳碳键特别灵敏，更容易鉴别某些芳香化合物。水有很强的红外吸收但其拉曼散射却特别弱。因此，拉曼光谱几乎不受水的影响，对含水物的鉴别很有用。拉曼光谱有两个主要不足：一是低检测浓度通常为10^-1～10^-2mol/L，二是许多物质中的杂质会发出荧光干扰拉曼散射信号的检测。 光反射测量法提供的红外光谱信息与发射光测量法的相似。由于光反射测量法仅探测样品的表面成分，克服了与光学厚度和物质散射性相关的困难。因此，反射测量用于强吸收物质的检测更容易。一种常用于红外反射光检测的特殊技术被称为衰减全反射（ATR），也被称为多重内反射（MIR））。 ATR技术的灵敏度很高，但重现性较差，不是一个可靠的定量技术，除非每个待测成分都有合适的内标。 荧光分光光度法比紫外分光光度法的灵敏度高。在荧光光谱中，空白溶液的信号很低，以致由背景发射产生的干扰要小得多。通常，浓度低于10^-5mol/L的化合物几乎不能用吸收光谱测定，而荧光光谱的测定浓度可以低至10^-7～10^-8mol/L。 对照品的使用 在鉴别、检查和定量测定中，使用对照品进行比较时，应保证供试品和对照品在相同的条件下进行测量。这些条件包括波长的设定，狭缝宽度的调整，吸收池的位置和校正以及透光率水平。吸收池在不同波长下透光率可能会有差异，必要时，应对吸收池进行多波长点的校正。 “同法制备”、“相同溶液”等描述，实际上是指对照样品（通常是对照品）和供试样品应同法制备，同法检测。在制备对照品溶液时，制备的溶液浓度（例如10%以内）只是期望浓度的近似值，而吸光度的计算则以的称量为基础；如果没有使用预先干燥的对照品，吸光度则应按无水物计算。 “同时测定”、“同时测量”等描述，是指特定空白溶液的吸光度、对照品溶液的吸光度和供试品溶液的吸光度应立即依序测定。