SPE固相萃取技术（固相萃取仪器装置）(六)

4.固相萃取材料

4.1键合硅胶固相萃取材料

C18

主要官能团：十八烷基（Octadecyl）；C18主要作用力是非极性，第二作用力是极性、阳离子交换。

      C18是十分常用的非极性材料。在所有反相硅胶填料中，C18的非极性吸附能力zui强。强非极性化合物被C18 吸附后很难洗脱。C18难吸附非常极性的分子，如碳水化合物（Carbohydrates）等。

      通常C18被当作zui没有选择性的填料，因为绝大多数有机分子或多或少含有非极性基团，C18可以从水溶液中吸附这些有机化合物。因此，C18对于同时分离不同结构的化合物时较为适用。由于C18的选择性较低，其zui终萃取物往往没有其他选择性高的填料。C18是的除盐SPE柱，因为样品中的盐在C18柱上没有保留。C18的极性副作用力比其他SPE填料低许多。主要是碳链较长的原因。

C8

主要官能团：辛基（Octyl）；主要作用力是非极性，第二作用力是极性、阳离子交换。

     C8的性质与C18十分相近，但对非极性化合物的吸附能力没有C18强，因为C8的碳链相对较短。正因为如此，对于一些在C18上吸附太强难以洗脱的化合物，可以用C8来取代。C8的极性作用力比C18要强。因为C8的碳链较短不能覆盖硅胶的表面。尽管如此，极性作用力依然不是C8的主要作用力。

C2

主要官能团：乙基（Ethyl）；主要作用力是非极性、极性，第二作用力是阳离子交换。

      因为C2的碳链十分短，使得硅胶上的硅烷醇（Si-OH）较为暴露在填料表面。这使得C2具有相当显著的极性特点。通常在实际应用中，如果目标物在C18或C8上吸附作用太强，可用C2来取代。C2的极性作用力比CN要略为强些。

CH

主要官能团：环己基（Cyclohexyl）；主要作用力是非极性，第二作用力是极性、阳离子交换。

环己基是中等极性的SPE填料。对特定的化合物有相当的选择性。当作为非极性填料使用时，CH基的极性与C2大致相同。在用CH柱从水溶液中分离苯酚这类极性化合物时，CH填料表面的极性特性显得十分重要。由于CH基的这种选择性，当C18、C8、C2不能选择性地吸附目标化合物时，可以考虑使用CH。

PH

主要官能团：苯基（Phenyl）；主要作用力是非极性，第二作用力是极性、阳离子交换。

      苯基在非极性萃取是十分常用的填料。其极性与C8相当。由于苯环的电子云作用，PH基与CH基相同，具有一定的选择性。

CN

主要功能团：氰丙基（Cyanopropyl）；主要作用力是非极性，极性，第二作用力是阳离子交换。

      氰丙基是常用的中等极性填料。当目标化合物在C18、C8的吸附是不可逆时，改用CN基填料较为有效。另一方面，当使用极性填料（如Si或2OH时）发现目标化合物的吸附是不可逆时，也可以用CN基填料取代极性填料。

2OH

主要官能团：二醇基（Diol）；主要作用力是极性，非极性，第二作用力是阴离子交换。

      二醇基是具有相当极性的填料，特别适用于从非极性溶剂中萃取极性化合物。二醇基十分相似于未键合的Si-OH能够与化合物形成较强的氢键。与硅胶类似，二醇基能够分离结构相似的化合物，如异构体。由于二醇基具有碳氢链结构，所以也有相当的非极性吸附功能。如从极性的尿液中萃取THC。

NH2

主要官能团：氨丙基（Aminopropyl）；主要作用力是极性、阴离子交换，第二作用力是非极性、阳离子交换。

      NH2基填料具有所有官能团的特征。因此在使用NH2填料时要特别注意溶剂/样品基液环境。NH2基是很强极性及强氢给予体的填料，具有阴离子交换剂的功能。NH2的pKa值为9.8，当体系pH值低于9.8时，NH2带正电。

      与SAX基比较，NH2属于弱阴离子交换剂。因此，要吸附强阴离子时，NH2是十分理想的填料。如硫酸等在SAX上的吸附是不可逆的，就是选用NH2填料。

      虽然NH2具有非极性特征，能够从极性溶液中萃取非极性化合物，但是其强极性特征使得非极性特征比其他特征要弱得多。与2OH及SI一样，NH2特别适用于分离异构体。

PSA

主要官能团：乙二胺-N-丙基（Ethylenediamine-N-propyl）；主要作用力是极性、阴离子交换，第二作用力是阳离子交换、非极性。

      PSA的特征与NH2相同是阴离子交换剂。PSA有两个胺基，具有较高的离子交换容量（1.4 meq/g，而NH2为1.1 meq/g）。其pKa较高，伯胺基为10.1，仲胺基为10.9。PSA的阴离子交换能力比NH2要强。PSA的功能团是一个很好的二元配位体，这使PSA成为很好的螯合填料。其多碳结构使得PSA的非极性作用力比NH2要强。因此，如果强极性化合物在NH2上吸附力太强，就可以用PSA代替。

DEA

主要官能团：二乙基胺丙基（Diethylaminopropyl）；主要作用力是极性、阴离子交换，第二作用力是阳离子交换、非极性。

      类似于PSA，DEA也与NH2具有相同的特征。作为阴离子交换剂，其吸附容量相对较小（1.0 meq/g），同时，由于其官能团的碳链使其具有较高的非极性特征。DEA的pKa值为10.7。DEA的碳链使得其即使在有胺官能团存在下也具有中等的极性特征。DEA的极性比C8强，但是比C2或CN弱。

SAX

主要官能团：*基胺丙基（Trimethylaminopropyl）；主要作用力是阴离子交换，第二作用力是非极性、极性、阳离子交换。

      SAX是zui强的阴离子交换剂。由于其功能团是季胺，这种填料总是带正电。由于官能团上的碳原子被胺遮蔽，SAX的非离子作用力十分小。在非极性溶剂中SAX具有一些极性特征，但是由于胺的空间阻碍及季胺的性质，SAX的极性作用力不能很好地形成氢键。

      由于SAX的强阴离子作用力，这种SPE柱一般不用于吸附很强的阴离子，如硫酸等。因为吸附后难以洗脱。由于SAX不能通过改变pH值来使其中性化，洗脱一般使用的是高选择性的反离子。SAX对于弱阴离子是很好的SPE填料。如羧酸类化合物。这类化合物在弱阴离子交换剂上不能很好地被吸附。

CBA

主要官能团：羧甲基（Carboxymethyl）；主要作用力是阳离子交换，第二作用力是非极性、极性。

      CBA基属于中等极性的填料。在实际应用中CBA基显极性还是非极性特征取决于环境的情况。

      CBA基一个十分有用的特征是其弱阳离子交换的性质。在有机化合物中，zui常见的阳离子是胺类。胺类的pKa一般都较高，在中性化时需要在较高的碱性条件下进行。正因为如此胺类化合物一般较难从类似于SCX基这种强阳离子交换剂上洗脱下来。另外，大多数阳离子并没向阴离子一样有很大范围的相反离子（counter-ion）选择性，这样就限制了利用高选择性的相反离子洗脱的可能性。

     由于CBA基的pKa值为4.8，在出现上述问题时，采用CBA填料就能够很好地解决洗脱问题。在pH4.8以上，CBA带负电，可以吸附带阳离子的目标化合物；当pH值在4.8以下时，CBA变为中性，这样被吸附的目标化合物就可以被洗脱下来。正是这个原因，在处理强阳离子时，CBA基填料是的阳离子交换剂。

PRS

主要官能团：丙磺酸基（Sulphonylpropyl）；主要作用力是阳离子交换，第二作用力是极性、非极性。

      PRS基是个极性非常强的阳离子交换剂。其非极性作用力很弱，一般难以利用。在非极性溶剂中，PRS基具有极性及氢键合作用力。PRS基的pKa值非常低，一般阳离子必须用高离子强度的溶液洗脱或将目标化合物中性化从而将其洗脱。一般来说，PRS基只适用于弱阳离子的吸附，如吡啶类化合物。

SCX

主要官能团：丙苯磺酸基（Propylbenzenesulphonyl）；主要作用力是非极性、阳离子交换，第二作用力是极性。

      SCX是强阳离子交换剂，具有很低的pKa值。其离子性质与PRS基相近。SCX与PRS主要的不同之处在于SCX填料表面的苯环具有较高的非离子作用能力。这种非离子特点在用离子交换机理从水相中萃取目标化合物时必须考虑。

     CX基的双重性对于目标化合物既离子又有非离子特征时特别有用。在吸附目标化合物后，可以用非极性溶剂及高离子强度的溶剂洗涤SPE柱而不会造成目标化合物流失。目标化合物可以用一种能够同时破坏非极性及离子作用力的溶剂洗脱。如甲醇/HCl。SCX的这种双重特性比单一功能的填料在清除杂质是要好得多。

4.2无机固相萃取材料

SI

主要官能团：非键合的活性硅土（Unbonded, activated silica）；主要作用力是极性，第二作用力是阴离子交换。

      SI被人们认为是zui强的极性填料。未键合的活性硅具有酸性。硅胶的这种特性使得其可以吸附空气中的水分，因此必须注意在使用前需确保其干燥。由于SI的高极性，在使用SI填料进行极性吸附时一定不能使用极性溶剂处理SI柱。如果需要在SPE柱预处理时使用极性溶剂，则应该改用2OH或NH2填料。

      在分离结构相似的化合物时，SI是理想的填料。将目标化合物溶在非极性溶剂中，然后通过增加THF或乙酸乙酯来逐渐增加溶剂的极性将机构相近的化合物分开。

弗罗里硅藻土

      弗罗里硅藻土是极性吸附剂。适用于从非极性的基液中萃取极性化合物（如胺类、羟基类及含杂原子或杂环化合物）。

氧化铝

结构：Al2O3

      酸性氧化铝（Al-A）的pH约为5，具有很高的活性。酸性氧化铝可以通过铝金属的中心与化合物羟基的氢形成氢键将化合物吸附。或通过离子交换将带有负电荷的化合物吸附。可以通过控制氧化铝表面的pH来控制其吸附作用。用酸洗氧化铝可以使得其吸附碱性化合物的能力下降。酸性氧化铝主要用于吸附极性化合物或具有阴离子官能团的化合物。

      中性氧化铝（Al-N）的pH约为6.5，具有很高的活性。中性氧化铝可以通过铝金属的中心与化合物羟基的氢形成氢键将化合物吸附。或通过离子交换将带有负电荷的化合物吸附。可以通过控制氧化铝表面的pH来控制其吸附作用。中性氧化铝的表面能够通过其铝原子中心与带有高负电荷的杂原子（杂环化合物）作用。如：N、O、P、S。也可以与富电的芳香结果的化合物作用。这种填料可以将胺类或芳香族化合物从水相或非水相基液中吸附。

    碱性氧化铝（Al-B）的pH约为8.5，具有很高的活性。碱性氧化铝可以通过铝金属的中心与化合物羟基的氢形成氢键将化合物吸附。或通过离子交换将带有负电荷的化合物吸附。可以通过控制氧化铝表面的pH来控制其吸附作用。用碱性溶液淋洗这种填料使得填料表面带负电。具有阳离子官能团的化合物可以通过碱性氧化铝表面的负电荷吸附。碱性氧化铝主要用于吸附极性化合物或具有阳离子官能团的化合物。

活性碳

      活性碳是zui早使用的含碳固相萃取材料。主要用于萃取中等极性至低极性的有机化合物。由于这种材料对部分目标化合物的吸附常常是不可逆的，而且对一些化合物的回收率较低。因此，目前很少使用这种材料。

石墨碳黑（Graphitized carbon black）

      石墨碳黑（GCB）是通过对碳黑加热(2700-3000℃)而得到的。主要用于萃取非极性及中等极性有机化合物。早期的石墨碳黑是无孔的。表面积在100m2/g。近期的石墨碳黑表面积可达210 m2/g。由于氧的化学吸附，碳黑表面结构上含有氧复合物。其结构类似于含氢醌、醌、等。这些功能团具有很强的极性，可以吸附一些酸性化合物。由于这些功能团的存在，石墨碳黑表面带有一些正电荷，具有阴离子交换的功能。

多孔石墨碳（Porous Graphitized carbon）

      多孔石墨碳 (PGC) 具有平面晶体的表面，六个碳原子组成的平面六角形具有显著的疏水（非极性）特征。对石墨碳进行处理后得到的多孔石墨碳商品化的多孔石墨碳的颗粒大小与硅胶材料相近。其平均表面积在120 m2/g。多孔的平均直径为25 nm。多孔率为75%。这种材料几何结构稳定，不会膨胀及收缩。可以在所有的pH范围使用。多孔石墨碳萃取机理与传统的C18及PS-DVB聚合材料有明显的不同。由于多孔石墨碳是通过范德华力将其多层水晶结构合为一体，多孔石墨碳可以通过疏水作用及电子作用吸附非极性以及极性化合物，包括水溶性的化合物。

4.3高聚物固相萃取材料

为了解决硅胶材料的多种作用力的问题，人们开始采用高聚物作为色谱或SPE材料。为了满足固相萃取的要求，这些高聚物往往需要经过交联，使其性质更加稳定。目前较为常见的是聚苯乙烯-二乙烯苯[(poly)styrene-divinyl- benzene，简称PS-DVB或SDB]为填料的聚合物SPE柱。由于聚合物填料没有以硅胶为基质常见的硅羟基，因而萃取机理单一，不会产生键合硅胶柱常见的副作用力。采聚合物SPE柱的另一个好处是这种材料可以在pH1-14广范围使用。

GDX 401

GDX401是由二乙烯苯和含氮杂环化合物共聚而成的高分子聚合物。中等极性，略呈碱性。表面积为370 m2/g。

GDX403

GDX403是由二乙烯苯和N-乙烯吡咯烷酮共聚而成的高分子聚合物。同时具有亲水及亲脂的特点。表面积为280 m2/g。由于是共聚物所以可以在pH0-14范围使用。可以用于取代C18柱。

H2O-Philic DVB（J.T. Baker）

H2O-Philic DVB填料是疏水二乙烯苯共聚物。可以在pH0-14范围使用。可以用于取代C18柱。其功能类似于Waters的Oasis HLB。柱容量为 0.85 μeq/mg。

H2O- Philic SC-DVB（J.T. Baker）

H2O-Philic SC-DVB填料是疏水磺酸-二乙烯苯共聚物。属于非极性及阳离子交换混合型SPE柱。可以在宽pH范围使用。其反相非极性柱容量为0.85 μeq/mg；阳离子交换柱容量为0.8 μeq/mg。该填料类似于Oasis MCX。

H2O- Philic SA-DVB柱（J.T. Baker）

H2O-Philic SC-DVB填料是疏水季胺-二乙烯苯共聚物。属于非极性及阴离子交换混合型SPE柱。可以在宽pH范围使用。其反相非极性柱容量为0.8 μeq/mg；阳离子交换柱容量为0.6 μeq/mg。该填料类似于Oasis MAX。

Oasis HLB柱（Waters）

HLB填料是N-乙烯吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物。同时具有亲水及亲脂的特点。其表面积比普通的C18填料高2-3倍，因此其柱容量也比普通C18柱高。HLB柱可以用于取代C18柱。

Oasis MCX柱（Waters）

MCX填料是N-乙烯吡咯烷酮-苯磺酸共聚物。属于阳离子交换及反相非极性混合填料。这种填料没有传统硅胶填料的羟基的影响。由于是共聚物所以可以在pH0-14范围使用。其阳离子容量为1 meq/gram。

Oasis MAX柱（Waters）

MAX填料是乙烯吡咯烷酮-季胺基共聚物。属于阴离子交换及反相非极性混合填料。这种填料没有传统硅胶填料的羟基的影响。由于是共聚物所以可以在pH0-14范围使用。其阴离子容量为0.3 meq/gram。

4.4混合型固相萃取材料

早在90年代初，混合型SPE柱（mixed-mode SPE columns）就已经面世。混合型SPE柱的填料一般具有两个以上的萃取。有的是两种不同填料混合物，也有是在同一填料上键合不同的萃取官能团。zui常见的是非极性官能团（如C8）与离子交换官能团（如强阳离子交换剂或强阴离子交换剂）。对于一些基质较为复杂（干扰物多，特别是离子干扰物及非极性干扰物较多）的样品，或样品中存在的待监测目标化合物性质不同，用单一萃取机理的SPE柱难以达到的萃取接过时，就可以使用混合型SPE柱。

      如下图所示，应用混合型SPE柱（C8-丙苯磺酸基）对于5含有大量离子及非极性干扰物样品中的弱碱性或两性化合物的萃取分离，可以先将样品的pH值调节到目标化合物呈中性，通过非极性作用力与填料上的C8官能团结合，此时可以用极性强的水等溶剂zui大限度地处去离子干扰物。之后，调节环境pH使目标化合物呈阳离子状态，被丙苯磺酸基吸附。此时可以用包括甲醇在内的有机溶剂洗涤，以除去非极性干扰物。zui后，通过调节环境pH至碱性，使目标化合物呈中性，通过有机溶剂洗脱。下图是应用多种作用力从复杂样品基质中分离目标化合物的示意图。

      应用混合型SPE柱进行药物筛选分析样品前处理就是利用混合型SPE柱不同功能团对性质不同的酸性、中性、碱性药物进行一次性萃取的一个例子。

键合硅胶C8– 强阳离子交换混合柱

      zui典型的键合硅胶型混合柱是Varina公司生产的Bond Elut Certify。这种混合型SPE柱具有C8及磺酸基。

键合硅胶C8 – 强阴阳离子交换混合柱

      zui典型的键合硅胶型混合柱是Varina公司生产的Bond Elut Certify II。这种混合型SPE柱具有C8及强阴离子交换剂。

聚合物混合型柱

      以聚合物为材料的混合型柱的代表应该是Waters公司生产的Oasis MCX及Oasis MAX。前者是具有非极性与强阳离子交换剂的功能；后者则具有非极性与强阴离子交换剂的功能。

4.5免疫亲和固相萃取材料

免疫检测（Immunoassay）具有速度快、灵敏度高、花费低的特点。当是，这种技术较难区别交叉反应物，不能够定量分析。将免疫检测技术与色谱技术结合在一起就成为了具备两者特点的免疫色谱技术（Immunochromatogrphic techniques）。免疫亲合萃取（Immunoaffinity extraction）技术是免疫色谱技术的一个主要应用。免疫亲合固相萃取柱 (IASPE) 与经典的固相萃取柱的不同之处在于IASPE柱中的功能组分是抗体，而不是我们常说的功能团。这些抗体包括单克隆及多克隆抗体。通过共价结合、包埋或生物分子俘获等方式将这些抗体固定在固相萃取材料上就形成了免疫亲合固相萃取材料。

     免疫亲合萃取的基本原理如下图所示，将样品载入免疫亲合固相萃取柱上，目标化合物及交叉反应物（cross-reactants）被键合保留在免疫亲合柱上。通过温和的洗涤步骤将弱键合干扰物除去。zui后将小心地用混合溶剂或缓冲溶液将目标化合物洗脱。

     目前已有许多商品化的免疫亲合固相萃取柱面世。免疫亲合固相萃取技术已经被应用于生物毒素（如黄曲霉素、玉米烯酮、赭曲霉素等）、多环芳烃（PAHs）及除草剂的萃取净化。

4.6分子印记固相萃取材料

分子印记固相萃取柱是以分子印记聚合物（Molecularly Imprinted Polymers, MIP）为填料的。这种材料对目标化合物的亲合力具有类似于抗体的高选择性。

分子印记聚合材料具有高稳定性和高选择性。所吸附的目标化合物在三维立体结构及功能团必须满足分子印记聚合材料相对应的结构。因为只有符合上述条件的目标化合物才能够很好地“镶嵌”在分子印记材料上。

       分子印记聚合材料的合成可通过共价及非共价方式进行。共价合成方式较少使用。较多使用的是非共价方式。如下图所示，非共价合成方式一般分为三步：*步是将印记模板与带有功能团的单体组合为一体。第二步是在交联剂及聚合引发剂的作用下完成*步得到的单体-模板与刚性多孔共聚物聚合；第三步是将印记模板除去得到具有特定结构的分子印记聚合材料

      目前，市场上已有多种商品化的分子印记固相萃取柱面市。其应用有包括盐酸克仑特罗在内的β-兴奋剂、苯塔松、三嗪类药物、茶碱、尼古丁及其同系物、三苯氧胺（抗雌激素）等。

4.7限进介质固相萃取材料

在使用JTONE系列固相萃取柱萃取富集生物样品中的小分子分析物中，经常遇到样品中的大分子蛋白质、核酸等遇到疏水性反相SPE填料时发生变性。变性后的大分子吸附在填料的表面，造成SPE柱堵塞、柱效下降、吸附容量减少等问题。限进介质SPE填料在一定程度上解决了上述问题。这种SPE填料同时具有对大分子的体积排阻功能及对小分子的萃取功能。

      人们通过对填料孔径的控制及对填料表面进行适当的亲水性修饰，使得生物或环境样品中的大分子不能进入填料的孔径内。而表面亲水性的填料使得生物大分子在填料表面不会发生不可逆的变性及吸附。

     由于大分子不被吸附，所以在死体积或近于死体积的情况下被洗脱除去。而填料孔内的反相或离子交换官能团则吸附样品中的小分子。这样就实现了在大分子存在的条件下选择性地吸附小分子的目的。

     目前RAM主要应用领域是生物体液的分析。包括细胞培养液、牛奶、尿液、清、浆等。主要测定的药物包括：安定类、β阻滞剂、阿托品、普鲁卡因等碱性药物、激素类。也有用于有机磷酸三酯农药的样品净化。在环境监测中的应用主要包括河水、湖水、地表水、废水中的除草剂残留、农药残留及激素残留的样品处理。

SPE固相萃取技术（固相萃取仪器装置）(六) 参考资料：杭州聚同电子有限公司  http://www.hz-jtone。。ｃｏｍ