炎症是机体受到外界微生物入侵后的一种保护性反应。作为影响最大的炎症诱导剂，内毒素脂多糖（LPS）为革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖成分。巨噬细胞通过产生促炎细胞因子被 LPS 激活，其他炎症介质包括活性氧（ROS）、前列腺素E2（PGE2）和诱导型环氧合酶-2（COX-2）。此外，参与控制炎症的另一个途径是核转录因子红系2相关因子2（Nrf2）。大量研究表明，Nrf2 有助于预防多种疾病，包括癌症、心血管疾病、神经退行性疾病和炎症。肠道不仅是人体重要的消化吸收器官，也是最大的免疫器官。肠上皮细胞和各种免疫细胞分布在肠黏膜内，包括巨噬细胞、树突状细胞和上皮内淋巴细胞，在肠黏膜免疫中发挥重要作用。巨噬细胞作为先天免疫的效应细胞，在肠道固有层中吞噬和清除细菌并分泌细胞因子，从而维持肠道环境的稳定。Caco-2 细胞模型不仅可用于研究肠道吸收和转运机制，还可用于体外研究肠黏膜上皮细胞的分泌和屏障功能。细胞共培养模型可以模拟体内微环境，在一定程度上弥补了单层细胞培养对生理环境模拟的不足。上皮细胞与免疫细胞的共培养是体外研究肠上皮细胞与黏膜内免疫细胞相互作用机制的有力方法。因此，南昌大学食品科学与技术国家重点实验室课题组的一项研究通过 LPS 处理建立 RAW264.7 巨噬细胞和肠上皮样 Caco-2 细胞的共培养模型，以模拟炎症性肠道环境。灵芝是一种药食两用的菌类。研究人员实验室分离出一种主要的多糖成分，命名为灵芝多糖（PSG-1），纯度>99.8%。已发现 PSG-1 具有多种生物活性，例如抗肿瘤活性、化学保护作用和免疫调节作用。该研究旨在探讨 PSG-1 对 LPS 诱导的炎症巨噬细胞模型和 Caco-2/RAW264.7 共培养炎症模型的直接和间接调控作用，旨在阐明其抗炎作用的潜在机制。PSG-1 降低 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞和肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养模型中细胞因子的分泌实验先测定 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞和肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养模型中细胞因子的产生，以检测 PSG-1 的抗炎作用。首先确定在 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞和肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养模型中，PSG-1 是否可以抑制 LPS 诱导的 TNF-α、IL-6、IL-1β 的分泌。与未刺激的细胞相比，LPS 显著增加了 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞中 TNF-α、IL-6 和 IL-β 的分泌。然而，当 PSG-1 与 LPS 处理的 RAW264.7 巨噬细胞共培养时，PSG-1 处理（160 μg/mL）使这三种促炎细胞因子的分泌分别减少了 60.5%、32.1%、46.1%。在模拟肠道炎症的 Caco-2/RAW264.7 共培养模型中，还分析了促炎细胞因子的分泌。在 PSG-1 存在下，肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养模型中，炎症刺激后测量 TNF-α、Il-6、IL-1β 的水平。PSG-1 降低 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞和肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养模型中细胞内 ROS 的产生
ROS 的过量产生导致氧化应激，损伤与炎症相关的疾病中的细胞和组织。为了探索 PSG-1 对氧化应激的特性，通过流式细胞术检测细胞内 ROS 的产生。当 RAW264.7 巨噬细胞用 LPS 刺激时，细胞内 ROS 的产生增加且上调显著，而 PSG-1+LPS 联合处理时这些效应呈浓度依赖性减弱（分别为 47.9%, 75.8 %、94.3%）。类似的趋势出现在肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养炎症模型中，PSG-1 减少 LPS 刺激的共培养炎症模型中的 ROS 产生。
PSG-1 抑制 LPS 诱导的 COX-2 表达的激活为了研究 PSG-1 的潜在抗炎作用，通过蛋白质印迹分析确定了 COX-2 的表达。对照组很少检测到 COX-2 的表达。然而，LPS 处理后表达显著上升，在 LPS 刺激的 RAW264.7 巨噬细胞（20.3%、55.9%、56.2%）或肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养模型（38.1%、57.7%、60.5%）中，用 PSG-1 处理 RAW264.7 巨噬细胞或肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养模型均以浓度依赖性方式抑制了 LPS 诱导的 COX-2 水平。PSG-1 抑制 LPS 诱导的 MAPKs 信号通路激活炎症介质的产生也受 MAPKs 控制。使用蛋白质印迹分析检测 PSG-1 对 RAW264.7 巨噬细胞和肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养模型中 LPS 诱导的 Erk1/2、JNK 和 p38 MAPK 磷酸化的影响。LPS 刺激显著增加 RAW264.7 巨噬细胞中磷酸化的 ERK、JNK 和 p38 表达。同时，PSG-1 显著抑制 LPS 诱导的 Erk1/2、JNK 和 p38 磷酸化。PSG-1 在肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养模型中抑制 LPS 诱导的 Erk1/2、JNK 和 p38 磷酸化。PSG-1 调节 Nrf2/keap1 介导的氧化应激信号通路Nrf2/kelch 样 ECH 相关蛋白1（Keap1）信号通路的蛋白质表达是在 LPS 单独刺激或在 RAW264.7 巨噬细胞和肠样 Caco-2/RAW264 中存在 PSG-1 的情况下测定的。在 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞中，实验发现与对照组相比，LPS 刺激降低了 Nrf2 的表达，而与 LPS 组相比，在 80 或 160 μg/mL 剂量下与 PSG-1 联合使用可显著提高（42.3%、25.8%）Nrf2 的活性。同时，如在 LPS 刺激的肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养模型中观察到的（图5 B），LPS 刺激诱导 Nrf2 表达的显著下调，在 LPS 诱导 Caco-2/RAW264.7 共培养模型（30.7%, 106%）中，PSG-1 处理（40, 160 μg/mL）后 Nrf2 水平显著升高。此外在 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞中，暴露于 LPS 后 Keap1 的蛋白水平降低，而 LPS+PSG-1 处理较 LPS 组相比，Keap1 显著上调（33.0%、78.8%、31.7%）。肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养模型仅用 LPS 处理时，Keap1 的表达减少。然而，PSG-1 处理显著上调 LPS 诱导的 Caco-2/RAW264.7 共培养模型中 Keap1 的表达（34.4%、41.2%、103.0%）。总之，该研究证明 PSG-1 降低 LPS 诱导的促炎细胞因子（TNF-α、IL-6 和 IL-1β）的分泌和 ROS 水平，并抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞中 COX-2 的表达。此外，PSG-1 抑制 LPS 诱导的 MAPKs 信号通路激活，并通过激活 Nrf2/Keap1 信号通路调节氧化应激。同时，在肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养模型中也观察到了类似的趋势（图6）。因此推测 PSG-1 不仅对 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞具有直接的抗炎作用，而且在肠样 Caco-2/RAW264.7 共培养模型中也具有间接的抗炎作用。这些发现为开发 PSG-1 作为功能性食品或营养制剂中潜在的抗炎成分奠定了基础。参考文献：Hu X, Yu Q, Hou K, Ding X, Chen Y, Xie J, Nie S, Xie M. Regulatory effects of Ganoderma atrum polysaccharides on LPS-induced inflammatory macrophages model and intestinal-like Caco-2/macrophages co-culture inflammation model. Food Chem Toxicol. 2020 Jun;140:111321. doi: 10.1016/j.fct.2020.111321. Epub 2020 Apr 11. PMID: 32289334.
