乳腺癌是一种异质性疾病，从局部上皮细胞的癌变转移进展为远端器官部位的继发肿瘤。转移级联中的所有步骤都涉及肿瘤细胞与其遇到的不同动态微环境之间的机械相互作用，包括暴露于流体流动。肿瘤细胞会遇到两种类型的流体流动：肿瘤微环境中的间质液流动（interstitial flow）和血管或淋巴微环境中的流体流动（fluid flow）。尽管已知流体流动会显著影响癌细胞的行为，但关于血管微环境中力的幅度如何影响癌症进展期间的细胞事件的信息并不多。0.1-1 Pa幅度的机械力已被证明通过激活信号通路和诱导转录因子来影响细胞表型，其中一些因子有EMT（上皮-间充质转化）有关。

EMT是指上皮细胞失去上皮表型，获得间质细胞表型的过程，期间细胞的粘附和力学特性发生显著改变，促进肿瘤细胞与原发肿瘤的分离。TGF-β通路以其参与癌细胞中的EMT而闻名。了解流体流动等机械力如何促进EMT和转移事件，将有助于识别可用于促进乳腺癌早期诊断和分类的关键基因，从而更好地确定患者的治疗方案。

一旦肿瘤细胞在血流的生物物理学力作用下存活下来，它必须粘附在继发性肿瘤形成部位的血管内皮细胞上，外渗，并在开始生长之前存活。癌细胞粘附需要在癌细胞和内皮细胞上表达同源配体和受体，特别是整合素、胶原蛋白、选择素和活化的白细胞细胞粘附分子（ALCAM）。其中一些粘附分子已被证明在癌症进展中起着关键作用，然而，没有研究调查乳腺癌细胞先前暴露于血流产生的剪切应力如何影响参与促进随后粘附到内皮细胞的基因的表达。

在加拿大卡尔加里大学细胞和分子生物工程研究实验室团队的一项研究中，利用平行板流动室组成的生物反应器系统将乳腺癌细胞暴露于中等水平的流体流动中，基因表达分析用于评估血流诱导的乳腺癌细胞的变化，网络分析用于确定参与促进EMT和细胞粘附的基因之间的关键相互作用。研究人员假设以流体流动产生的剪切应力刺激乳腺癌细胞会增加乳腺癌细胞对内皮细胞的粘附，此外，还评估了流动刺激和未刺激的乳腺癌细胞在体外粘附内皮细胞单层的能力。相关成果发表在 Breast Cancer Research 期刊题为“Fluid flow exposure promotes epithelial-to-mesenchymal transition and adhesion of breast cancer cells to endothelial cells”。

流体流动影响乳腺癌细胞系基因表达并富集参与转移的细胞过程

为了研究流体流动对乳腺癌细胞系基因表达的影响，将BT-474、MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞暴露于1 Pa大小的剪切流中。分析全基因组表达数据时，观察到流动暴露和非暴露细胞之间的基因表达谱存在显著差异（图1 a）。剪切力暴露时，每个乳腺癌细胞系中至少有150个基因差异表达（图1 b）。MDA-MB-231基底细胞系在流动刺激下具有差异表达最多的基因（图1 b）。基底细胞乳腺癌是乳腺癌zui;ju侵袭性的亚型之一，具有du;te的生物学特征，其特征是早期转移模式。

为了确定受流动暴露显著影响的关键分子功能和生物过程，进行了基因集富集分析。参与导致癌转移进展的细胞过程的基因亚群在流动刺激下在大多数细胞系中深度富集。在所有暴露于流动的乳腺癌细胞中，观察到参与调节EMT（图1 c），正调节细胞运动（图1 d），调节细胞-基质粘附（图1 e），以及正调节细胞间粘附（图1 f）的基因显著富集。此外，观察到几种胶原蛋白，整合素和其他细胞粘附分子（包括FN1和ALCAM）的上调，表明在流动暴露时癌细胞粘附性能的调节。

图1   （a）静态和流动暴露的MDA-MB-231，BT-474，SK-BR-3和MCF-7乳腺癌细胞之间差异表达基因的热图。（b）静态和流动暴露乳腺癌细胞之间差异表达基因的数量。乳腺癌细胞暴露于流体中，参与转移进展的分子过程丰富，包括上皮向间质转化的调节（c）、细胞运动的正调节（d）、细胞-细胞粘附的正调节（e）和细胞-基质粘附的调节（f）。

流体流动上调乳腺癌细胞中EMT基因和蛋白质的表达

为了进一步研究血流刺激时的EMT调节，分析了由人EMT的PCR阵列创建的EMT基因集中的基因表达。数据分析揭示了每个乳腺癌细胞系在流动刺激后差异表达的EMT基因的热图，包括EMT诱导因子如FN1、SNAI2、SERPINE1、NOTCH1、TCF4、MMP2、PLAU、WNT5A和WNT5B的一致上调。EMT抑制因子，如KRT19和TSPAN13在几种细胞系中下调。此外，观察到在MDA-MB-231细胞中，在0.2 Pa和0.6 Pa的较低剪切应力刺激和停止刺激后，流动诱导的SNAI2上调持续了24小时。

此外，还比较了MDA-MB-231细胞的静态和流动来源的EMT蛋白表达谱。在流动刺激的MDA-MB-231细胞中，通过同时上调Snail和Vimentin来促进EMT。这些发现与VIM和SNAI2的qPCR表达数据一致，VIM和SNAI2分别编码Vimentin和Snail。E-钙黏蛋白在MDA-MB-231细胞中以低水平表达。此外，还观察到在MCF-7和BT-474细胞的流动暴露中CDH1轻微或没有下调，CDH2上调，表明向更多的间充质表型转变。

接下来，比较了在化学诱导EMT、流体流动刺激或在静态条件下培养的HMECs（人乳腺上皮细胞）中E-钙黏蛋白、Vimentin和Snail的表达水平。与静态对照相比，Snail 和Vimentin在流动暴露和EMT诱导的细胞中均上调，而E-钙黏蛋白在三种条件下的表达没有显著差异，流动刺激的HMECs中SNAI2和VIM上调，CDH1变化不显著。这些结果表明，将HMECs暴露于流体流动会刺激向EMT表型的进展，类似于化学诱导。

Smad3 而非 smad2 敲低影响流动诱导的 SNAI2 上调

Smad2/3是癌症中EMT的已知调节剂，也已知具有血流反应性。在MDA-MB-231细胞中测量Smad2水平，发现在流动暴露后降低（图2）。为了研究Smad2或Smad3参与血流诱导的SNAI2上调，用Smad2或Smad3 siRNA转染MDA-MB-231细胞。SNAI2在对照和转染Smad2 siRNA的细胞中分别上调2.2和2.8倍。当用Smad3 siRNA转染细胞时，差异表达不显著（1.4倍）。用Smad2和Smad3转染分别导致 91% 和 86% 的敲低。

图2   （a）在MDA-MB-231细胞中通过蛋白质印迹测定的Smad2蛋白表达（总SMAD2和pSmad2-连接物）。（b）对照（-），Smad2或Smad3 siRNA转染并用流体流动刺激20小时的MDA-MB-231细胞中SNAI2表达的定量RT-PCR分析。

网络分析揭示了参与细胞流动反应的关键基因

为了可视化可能参与促进流动刺激乳腺癌细胞中EMT和细胞粘附的分子相互作用网络，使用Cytoscape软件平台导入并分析了流动暴露和静态对照的基因表达数据，数据表明，当乳腺癌细胞暴露于流动刺激时，蛋白质网络高度模块化。由于FN1在大多数流动暴露细胞中的过表达及其在EMT和细胞粘附中的作用，因此分析了其相互作用子网络，以更好地了解流动刺激如何影响乳腺癌细胞的转移事件。MDA-MB-231和 MCF-7 的FN1子网络揭示了FN1过表达可能促进乳腺癌细胞EMT和粘附的功能联系。

生物反应器衍生的表达变化概括了临床乳腺癌基因表达谱

为了研究实验的发现与人类乳腺癌进展的相关性，使用癌症基因组图谱（TCGA）的数据分析了FN1及其PLAU和ALCAM的基因表达数据。与健康志愿者相比，FN1，PLAU和ALCAM在大多数乳腺癌亚型患者中上调，大多数乳腺癌阶段患者的FN1，PLAU和ALCAM也上调。

接下来，在2878例患者的乳腺肿瘤微阵列数据集中评估FN1、PLAU和ALCAM的预后价值。与FN1和PLAU表达低的患者相比，FN1和PLAU表达高的患者的生存率降低。ALCAM表达的生存图显示出类似的模式。

流体流动刺激增加乳腺癌细胞的粘附、迁移和侵袭能力

最后，评估了流动刺激和未刺激的MDA-MB-231和MCF-7细胞粘附在内皮单层上的能力。图3 a显示了在未刺激和流动刺激的MDA-MB-231细胞流过内皮单层后获得的癌细胞-内皮细胞粘附图像。在超过4分钟的所有时间点，流动刺激的MDA-MB-4细胞比未刺激的细胞更多的粘附在内皮细胞上（图3 a、b）。此外，与未刺激的细胞相比，流动刺激的MDA-MB-231和MCF-7细胞在静态粘附实验中表现出对内皮单层的更强粘附（图3 c）。此外，还观察到MDA-MB-231（图3 d）和 MCF-7（图3 e）细胞在流动刺激后，一组关键的癌细胞粘附基因显著上调。Transwell迁移和侵袭测定用于研究流动刺激和未刺激细胞的迁移和侵袭能力。图3 f表明MDA-MB-231细胞暴露于流体流动会增加它们通过Transwell膜迁移和侵袭的能力。总之，这些结果揭示了暴露于流体流动在增强乳腺癌细胞在转移部位的迁移、粘附到内皮细胞和通过膜侵袭方面的潜在作用。

图3   （a）未刺激和血流刺激的MDA-MB-231细胞在几个时间点粘附在内皮单层的代表性相衬图像。流动（b）和静态（c）粘附研究中流动刺激（黑线）和未刺激（灰线）细胞的相对粘附。静态和流动暴露的MDA-MB-231（d）和MCF-7（e）乳腺癌细胞之间差异表达的细胞粘附基因的热图。（f）transwell 测定中流动刺激和未刺激的MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移和侵袭比较。

总之，该研究使用平行平板流室系统，创建了一个乳腺癌进展的实验模型，并鉴定了在患者群体中差异表达的生物标志物，表明1 Pa左右的流体剪切力可促进EMT和乳腺癌细胞与内皮单层的粘附，并且已鉴定的生物标志物在患者群体中明显表达。研究了解剪切应力等生物物理力如何影响乳腺癌转移进展所涉及的细胞过程对于识别疾病进展的新分子标志物和预测转移风险非常重要。这些发现支持使用基于流动的模型来进一步研究流体环境如何影响癌细胞及其转移能力。该研究结果表明，体外模型允许识别生物标志物，这些生物标志物可用于识别已经经历EMT的细胞以及可能正在循环的肿瘤细胞。使用该系统研究涉及乳腺癌发展和进展的细胞事件可能会为转移性乳腺癌提供新的诊断和治疗方法。

参考文献：Fuh KF, Shepherd RD, Withell JS, Kooistra BK, Rinker KD. Fluid flow exposure promotes epithelial-to-mesenchymal transition and adhesion of breast cancer cells to endothelial cells. Breast Cancer Res. 2021 Oct 12;23(1):97. doi: 10.1186/s13058-021-01473-0. PMID: 34641959; PMCID: PMC8507133.

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