髓核（NP）组织是一种凝胶状组织，主要由II型胶原蛋白和蛋白聚糖组成。髓核细胞（NPC）负责合成细胞外基质（ECM）成分（主要是II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖），在椎间盘（IVD）退变过程中首先表现出细胞凋亡和/或衰老样变化。在椎间盘退变中，衰老的NP细胞积聚并导致增殖减弱，自我修复受损，细胞功能下降以及功能性ECM破坏加剧。因此，治疗IVD退变的潜在策略是通过调节退变过程中涉及的潜在信号分子或通路来减轻或延缓NP细胞的凋亡和/或衰老样变化。

通常认为，施加在IVD上的超负荷压缩力是导致IVD退变的主要原因。既往研究表明，由于刺激蛋白聚糖合成，生理强度的压缩负荷（0.35-0.75 MPa）可作为NP和AF（纤维环）细胞的合成代谢因子。相反，过度压缩（≥ 1 MPa）加重了NP和AF细胞蛋白聚糖的分解代谢。尽管NP细胞压缩负荷相关生物行为变化的分子机制尚不清楚，但大多数研究指出，超负荷压缩诱导的NP细胞凋亡和衰老变化与机械敏感因子（如整合素和钙粘蛋白）触发的细胞内氧化损伤有关。因此，探索NP细胞压缩相关生物学变化中潜在的生物调节因子和信号通路具有重要意义。

在重庆医科大学附属第三医院骨科及附属第一医院泌尿外科、九龙坡区第一人民医院消化内科的一项联合研究中，以人NP细胞作为研究对象，利用自主研发的压缩负荷生物反应器，分析了NP细胞的凋亡和衰老样变化；并进一步使用基于串联质量标签（TMT-）的定量蛋白质组学分析了在非压缩，低压缩力（LC）和高压缩力（HC）负荷培养下的不同NP细胞之间的差异表达蛋白（DEPs），其中巨噬细胞移动抑制因子（MIF）和氧化应激相关通路在体内和体外进一步评估；还建立了MIF敲除（MIF-KO）NP细胞，以进一步确定MIF在经历超负荷压缩的NP细胞中的保护功能。相关内容发表在 Oxidative Medicine and Cellular Longevity 期刊题为“Deficiency of MIF Accentuates Overloaded Compression-Induced Nucleus Pulposus Cell Oxidative Damage via Depressing Mitophagy”。

该团队之前的研究证实，机械压缩诱导的水凝胶变形可以有效地模拟NP细胞或间充质干细胞（MSC）的体内负荷情况。因此，此次研究培养了NP细胞包裹的GelMA水凝胶，并使用自主开发的压缩负荷生物反应器提供间歇压缩负荷，以0%、5%、10% 和20% 的压缩变形施加仿生压缩力（1.0 Hz，4小时/天），处理样本分三组：对照组-0%、LC负荷组-5%变形、HC负荷组-20%变形。

首先，研究了梯度机械压缩对人 NP 细胞的细胞衰老、活力和 ECM 合成的影响。结果显示，HC组（变形≥10%）阳性细胞比例显著增加，而LC组（变形≤5%）无明显变化。荧光活/死染色结果也表明，超过10% 的压缩变形显著提高了NP细胞的死亡率，而LC组并无变化。检测细胞凋亡率的结果表明，HC组NP细胞的凋亡明显增强，LC组则无变化。此外，衰老相关标志物（P53、P21和P16）在遭受HC负荷的NP细胞中强烈过表达，而功能性ECM成分（聚集蛋白聚糖和II型胶原蛋白）的合成受到HC负荷的显著抑制，但在LC组中没有。

为了进一步分析压缩相关的NP细胞存活和衰老过程中的潜在功能因素，采用基于TMT的蛋白质组学分析，分别评估了对照组、LC负荷组和HC负荷组的DEPs （图1）。根据三组对比结果，推测LC负荷组中过表达的蛋白与HC负荷组中低表达的蛋白的交集可能是NP细胞存活的保护因子。相反，LC负荷组中低表达的蛋白与HC负荷组中过表达的蛋白的交集可能是NP细胞存活的不利因素。因此，进一步分析了蛋白质簇，并预测了NP细胞存活的8个潜在保护因子和3个潜在有害因子。在8个潜在的保护因子中，MIF 因其在调节椎间软骨终板（CEP）细胞命运中的作用而被选中进行进一步的研究。此外，GO和KEGG富集分析表明，压缩负荷通过调节氧化应激相关通路（ATP生物合成过程和氧化磷酸化）影响NP细胞的命运。

图1    TMT定量蛋白质组学程序的流程示意图：NP细胞包裹的水凝胶在0%（对照）、5% 变形（低压缩负荷）和20% 变形（高压缩负荷）的动态压缩下培养2周，蛋白质提取物用10-plex TMT试剂标记，通过LC-MS/MS分析多肽。

接下来，为了进一步验证MIF表达与压缩负荷相关的NP退变之间的关系，实验建立了大鼠尾部IVD超负荷压缩模型（图2 a）来检测其对大鼠尾部NP组织生物学行为及MIF表达的影响。根据先前的研究，从远端施加轴向力产生1.3 MPa的压缩负荷，然后根据压缩持续时间将大鼠分为三组：假手术组、2周负荷组、4周负荷组。压缩大鼠尾部IVD的图像表明，NP组织在2周的超负荷压缩下出现退变迹象，在4周的超负荷压缩下恶化（图2 b、c）。此外，HE染色的形态学分析还显示压缩大鼠尾部IVD在2周和4周内出现中度和重度退行性体征（NP丢失和AF纤维软骨薄片波纹增加）（图2 d、e）。阿利新蓝染色结果还显示，随着IVD压缩时间的延长，糖胺聚糖的含量逐渐下降（图2 f、g）。值得注意的是，MIF表达在遭受2周压缩的中度退行性NP中上调，但在遭受4周压缩的严重退行性NP中下调（图2 h、i）。

图2   超负荷压缩对大鼠尾部NP生物学行为及MIF表达的影响。

基于蛋白质组学数据，通过分析氧化应激相关生物标志物，进一步明确MIF相关NP退行性变化的分子机制。在分析氧化应激相关生物标志物之前，敲除内源性MIF（MIF-KO）不影响NP细胞的衰老速度，但HC负荷显著加重了NP细胞的衰老，而MIF-KO进一步加剧了HC负荷诱导的NP细胞衰老。然后分析了NP细胞中细胞内ROS含量，结果表明，单独敲除MIF不会诱导ROS的积累。然而，HC负荷确实增加了NP细胞中ROS的含量，并且MIF-KO显著增加了HC负荷处理的NP细胞中ROS的含量。此外，MIF-KO显著消除了MIF的表达，但衰老相关标志物（P53、P21和P16）和氧化应激相关标志物（NT）的表达不受MIF-KO的影响。与对照组相比，HC负荷降低了MIF的表达，显著增强了P53、P21、P16和NT的表达。同样，HC负荷处理的NP细胞中MIF的敲除进一步加剧了衰老相关和氧化应激相关标志物的表达。这些数据表明，MIF的缺失加剧了遭受超负荷压缩的人类NP细胞中氧化应激诱导的衰老。

线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，也是ROS的主要产生部位。之前的研究证实，线粒体自噬可以通过回收受损的线粒体来缓解氧化应激诱导的NP细胞衰老。因此，实验最后在当前研究的基础上进一步观察了线粒体自噬相关的标记。

蛋白质印迹结果表明，MIF-KO和HC处理均能下调PINK1和LC3II/I的表达，上调Parkin 和P62的表达，这是线粒体自噬阻断的标志（图3 a、b）。值得注意的是，HC处理的NP细胞中MIF的敲除进一步加剧了线粒体自噬相关标志物的抑制（图3 a、b）。JC-1染色结果表明，单独敲除MIF不会引起线粒体损伤，但HC负荷加重了NP细胞线粒体损伤（图3 c、d）。此外，HC处理的MIF-KO NP细胞具有最高的JC-1绿/红色荧光比，表明MIF的缺失加剧了HC负荷诱导的受损线粒体的积累（图3 c、d）。

为了进一步研究不同阶段的线粒体自噬，用编码GFP-LC3的质粒转染NP细胞，分别标记自噬体和线粒体，观察NP细胞中线粒体和自噬体的数量和形态。对照组和MIF-KO组NP细胞的线粒体保持正常的形态和结构，而在HC负荷处理的NP细胞中，线粒体明显wei;suo，膜密度增加。此外，HC负荷的细胞在其细胞质中表现出更多的自噬体，而用HC负荷的MIF-KO NP细胞在其细胞质中没有出现典型的自噬体。上述结果表明，MIF的缺失确实延缓了NP细胞的线粒体自噬，从而加剧了超负荷压缩下氧化应激诱导的NP细胞的衰老。

图3   MIF-KO加剧氧化应激诱导的NP细胞衰老和线粒体功能障碍。

图4    MIF调控超负荷压缩诱导的NP细胞衰老的潜在机制：超负荷压缩诱导线粒体损伤，触发NP细胞氧化应激相关衰老。MIF的缺失抑制了NP细胞的线粒体自噬，这进一步加剧了超负荷压缩力下NP细胞氧化应激相关的衰老。

总之，该研究表明，超负荷的机械压缩会导致人类NP细胞的氧化应激、线粒体功能障碍和退行性变化。相反，适当的生理压缩力有利于维持NP的细胞活力和ECM稳态。此外，MIF表达与NP细胞的机械压缩力相关的生物学变化之间存在一定的关系。MIF的缺失加剧了超负荷机械压缩下ROS的积累，线粒体功能障碍和衰老。该过程涉及的潜在分子机制与MIF的线粒体自噬诱导作用有关。该研究有助于我们更好地理解机械压缩应力在椎间盘退变过程中的调节作用，为使用MIF治疗椎间盘退行性疾病提供了更有力的证据。

参考文献：Wang Y, Hu Y, Wang H, Liu N, Luo L, Zhao C, Zhou D, Tong H, Li P, Zhou Q. Deficiency of MIF Accentuates Overloaded Compression-Induced Nucleus Pulposus Cell Oxidative Damage via Depressing Mitophagy. Oxid Med Cell Longev. 2021 Jul 1;2021:6192498. doi: 10.1155/2021/6192498. PMID: 34306312; PMCID: PMC8270705.

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