The TNFSF12/TWEAK Modulates Colonic Inflammatory Fibroblast Differentiation and Promotes Fibroblast-Monocyte Interactions

KWS：TNFSF12/TWEAK；Colonic Inflammatory Fibroblast；Differentiation；Monocyte；Cell Coculture

炎症性肠病（IBD）是溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）两种病症的总称，在不同的疾病阶段和致病性情况下均发现了炎症成纤维细胞。成纤维细胞特征和功能的改变成为 IBD 的关键影响因素，驱动致病性成纤维细胞功能的介质可能是治疗干预的希望靶点。

驱动成纤维细胞-免疫细胞通讯的介质和分子机制才刚开始被阐明。TNF 超家族（TNFSF）成员14（TNFSF14），也称为 LIGHT，被鉴定为一种成纤维细胞衍生因子，会抑制肠道类器官的生长。重要的是，TNFSF 的各种因子，包括TNFSF14、TNFSF12（也称为 TNF 相关的凋亡弱诱导剂TWEAK）或 TNFSF15 ，最近在临床前模型中确认与 IBD 和纤维化有关。

基于此，爱尔兰都柏林大学学院Conway生物分子与生物医学研究所的联合团队在一项研究中，集中探讨了 TWEAK 作为结肠成纤维细胞分化介质的潜力，并分析了其在成纤维细胞-单核细胞相互作用中的参与。研究发现TWEAK 具有作为转录抑制因子和诱导因子的双重作用，导致成纤维细胞分化为炎症细胞，并利用共培养模型探索了炎性成纤维细胞调节免疫细胞反应的潜力，发现暴露于 TWEAK 处理的人结肠成纤维细胞的 THP-1 单核细胞粘附并增加炎症标志物的表达。这些数据表明了 TWEAK 促进结肠炎性成纤维细胞分化和成纤维细胞-单核细胞相互作用。研究成果发表于 The Journal of Immunology 期刊题为“The TNFSF12/TWEAK Modulates Colonic Inflammatory Fibroblast Differentiation and Promotes Fibroblast-Monocyte Interactions”。

首先，为了测试 TWEAK 在结肠成纤维细胞分化中的作用，将原代人结肠成纤维细胞用 TWEAK 处理评估转录谱的变化。差异表达基因揭示了超过1200 基因的失调，而 TWEAK 作为基因诱导因子和抑制因子的作用相似，有 692 个诱导基因和 579 个抑制基因，其中上调的转录组由与炎症相关的基因填充（图1 A）。

值得注意的是，与抗原（Ag）呈递相关的几个过程，如 TAP1 结合和 MHC 蛋白结合，也在 TWEAK 上调数据集中富集，还上调了许多参与 Ag 加工和呈递以及对感染因子反应的基因（图1 B、D）。同时，TWEAK 促进了细胞因子（包括 IL-1B、IL-6、IL-12A、IL-15 或 IL-33）、趋化因子、免疫受体、TNFSF 介质/受体/接头、细胞粘附分子的基因表达（图1 C）。TWEAK 还诱导了基质重塑介质和炎性成纤维细胞标志物的表达，降低血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）的表达（图1 E）。这些数据表明，TWEAK 介导结肠成纤维细胞分化为不同的致病特征，促进参与炎症和 Ag 呈递的基因的表达，增加参与基质重塑的基因，并可能使参与上皮稳态的基因失调。

以往研究将结肠基质细胞分为四类，其中基质4（S4）亚群被确定为炎症群体，该亚群在正常结肠标本中几乎不存在，而在 UC 活检中增加。鉴于结肠成纤维细胞中 TWEAK 诱导的转录组的炎症性质，研究人员假设这类似于先前在 UC 中鉴定的 S4 亚群。为此，展开了一项比对研究，将 TWEAK 上调和下调的转录组与这四个基质群体中的每一个进行比较，发现TWEAK 诱导的反应与 S4 的同源性最高。与先前在 IBD 患者活检中报道的 TWEAK 受体（TNFRSF12/Fn14）的高表达一致，对 Fn14 在细胞群中的表达分析表明，该基因在 S4 细胞中dute存在，而 TWEAK 本身不被任何基质群表达。因此，TWEAK 在结肠成纤维细胞中诱导炎症转录程序，该程序与 UC 中的炎性成纤维细胞亚群部分一致。

图1   TWEAK诱导结肠成纤维细胞的炎症谱。

鉴于 TWEAK 介导的 ICAM-1 和 VCAM-1 上调，以及 CCL2 的高分泌，实验假设 TWEAK 诱导的炎性成纤维细胞促进单核细胞募集或激活。

接下来，为了研究它们的相互作用，将原代结肠成纤维细胞与THP-1细胞共培养，单培养的THP-1细胞（vehicle- 或TWEAK-）作为对照。与成纤维细胞共培养导致大量 THP-1 细胞粘附，从而形成两个细胞组分，以下称为悬浮和粘附组分（图2 A）。有趣的是，与成纤维细胞共培养上调悬浮 THP-1 细胞中粘附分子 CD11b的表达，表明该细胞组分也由与成纤维细胞共培养引发，尽管这仅通过用 TWEAK 预处理而略微增加（图2 B、C）。相反，THP-1 细胞的活力不受 TWEAK 的影响，且在单培养和共培养之间没有差异。

然后继续分析了 TWEAK 诱导的成纤维细胞对极化募集的单核细胞/巨噬细胞的可能性。CD14 是一种在单核细胞和巨噬细胞中发现的标志物，在单培养悬浮的 THP-1 细胞中表达极少，相反，在共培养物的悬浮 THP-1 中 CD14^high 细胞显著增加，这在与 TWEAK 处理的成纤维细胞的共培养物中进一步富集（图2 D、E）。有趣的是，CD14 表达也在暴露于 TWEAK 处理的结肠成纤维细胞条件培养基的 THP-1 细胞中被诱导，但程度低于直接共培养（图2 E）。此外，与 TWEAK 处理的成纤维细胞共培养的细胞中，ICAM-1^high THP-1 的频率更高（图2 F、G），热图分析还显示ICAM-1^high 和 CD14^high  THP-1 之间存在相关性（图2 F）。

进一步分析 THP-1 的贴壁部分，使用 CCR2 （在 THP-1 上高表达，在结肠成纤维细胞上缺失）和 CD90 （成纤维细胞标志物，在THP-1 上缺失）来区分粘附共培养中的两个细胞组分（图2 H）。实验观察到，与具有 CCD-18Co（图2 H、I）和 PB-H-6231的正常结肠成纤维细胞相比，TWEAK 处理的成纤维细胞共培养中粘附 CCR2^high CD90^- 细胞（原始巨噬细胞）数量显著增加，表明 TWEAK 刺激促进了成纤维细胞募集和粘附单核细胞的能力。有趣的是，与悬浮部分中的 THP-1 一样，粘附的 CCR2^high CD90^- 细胞的 CD14 水平明显更高（图2 J、K）。同样，尽管 TWEAK 在 THP-1 或成纤维细胞单培养物中未能上调 CXCL1 或 IL-8 的分泌，但与未处理的成纤维细胞共培养相比，THP-1/TWEAK 诱导的成纤维细胞共培养物中两种趋化因子均显著增加（图2 L）。这些数据表明，THP-1 细胞与结肠成纤维细胞共培养可促进其粘附、活化和趋化因子分泌，当用 TWEAK 预刺激成纤维细胞时，这种效应会增强。

图2   TWEAK 诱导的成纤维细胞募集并极化 THP-1 细胞。

发现 TWEAK 处理的结肠成纤维细胞促进 THP-1 粘附和分化后，又研究了原代单核细胞是否会表现出类似的反应，使用上述共培养模型，将原代单核细胞与结肠成纤维细胞进行单培养或共培养。与 THP-1 相反，观察到大多数单核细胞粘附在培养物中，无论是否存在成纤维细胞。培养 24 小时后，单培养单核细胞中 CCR2 的表达明显高于共培养，而在与  TWEAK处理的成纤维细胞共培养中CCR2 的表达zuidi，这可能代表一种单核细胞-巨噬细胞中介。

中度和高度表达 CD16 的单核细胞的频率比较显示，与单独的单核细胞相比，TWEAK 刺激的成纤维细胞共培养的原代单核细胞从 CD16^high 相对转变为 CD16^int（表示为 CD16^int/CD16^high 的比率）。此外，与正常成纤维细胞相比，TWEAK 处理的成纤维细胞共培养中 TREM-1^high （结肠炎模型和 CD 患者中致病性巨噬细胞的标志物）单核细胞的频率显著增加。这些数据表明，TWEAK 处理的成纤维细胞促进原代单核细胞分化和活化，表现为CCR2 和 CD16 表达的降低、TREM-1 表达的增加以及 CXCL1 和 CXCL10 趋化因子分泌的增加。

最后，研究人员对 TWEAK/S4 共同转录组进行了额外的String分析，重点关注信号传导介质、细胞因子和趋化因子（图3 A）。信号介质包括非经典 NF-κB RELB 和 NFKB2 的两个主要效应子，发现 TWEAK 在蛋白质水平上诱导非经典 NF-κB 前体 p100 裂解成 p52，从 4 小时开始，在 24-48 小时之间达到峰值（图3 B）。

鉴于上述发现，测试了非经典 NF-κB 信号的选择性抑制是否可以消除 TWEAK 诱导的结肠成纤维细胞的炎症分化。实验发现，用 NIK 抑制剂 SMI1 处理阻断了 TWEAK 介导的 VCAM-1 表达上调（图3 C）和 CCL2 分泌（图3 D），但它不影响 ICAM-1（图3 C），这表明对 TWEAK 的反应可能由多种信号通路协调。

此外，研究人员假设，抑制 TWEAK 介导的非经典 NF-κB 信号可以调节结肠成纤维细胞和单核细胞之间的相互作用，阻断后者的炎症极化。结果发现，当用 NIK SMI1 处理成纤维细胞时，CD14^high THP-1 细胞群在与 TWEAK 诱导的成纤维细胞共培养中减少（图3 E、F），与正常结肠成纤维细胞共培养中的水平相似，表明NIK 抑制剂至少部分损害了 TWEAK 诱导的成纤维细胞极化 THP-1 细胞的能力。这些数据表明，TWEAK通过非典型NF-κB介导结肠成纤维细胞炎症分化和单核细胞极化。

图3    非经典 NF-κB 调节 TWEAK 引发的成纤维细胞和单核细胞之间的相互作用。

图4    图形概要

TNFSF12/TWEAK 诱导结肠成纤维细胞的炎症特征。TWEAK 处理的成纤维细胞促进单核细胞粘附和炎性极化。抑制非经典 NF-κB 通路部分阻断了这种相互作用。

综上所述，该研究提供的数据揭示了 TWEAK 作为结肠成纤维细胞炎症分化介质的重要作用，诱导与先前在 UC 患者中发现的炎症成纤维细胞一致的转录程序。通过细胞系、原代单核细胞和共培养模型，研究发现 TWEAK 刺激的结肠成纤维细胞促进单核细胞的粘附和分化，改变关键炎症标志物如 CD14、CD16 或 TREM-1 的表达，并增强炎症趋化因子的分泌。这项研究将 TWEAK/Fn14 轴定位为肠道炎症中成纤维细胞-单核细胞相互作用的新兴调节因子，以及调节 IBD 中致病性成纤维细胞功能的有吸引力的治疗靶点。

参考文献：Matellan C, Kennedy C, Santiago-Vela MI, Hochegger J, Ní Chathail MB, Wu A, Shannon C, Roche HM, Aceves SS, Godson C, Manresa MC. The TNFSF12/TWEAK Modulates Colonic Inflammatory Fibroblast Differentiation and Promotes Fibroblast-Monocyte Interactions. J Immunol. 2024 Jun 15;212(12):1958-1970. doi: 10.4049/jimmunol.2300762. PMID: 38700420; PMCID: PMC11149899.

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