上手蛋白定量实验，我们有招儿
时间：2021-12-24 阅读：1382
蛋白质的结构复杂、功能各一、分子量存在巨大差异，目前还没有一个理想且通用的蛋白定分析方法。如今最常见的方法主要有以下几种：
原理
BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即 BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+,一个Cu*螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
特点
灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul 。
测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton x-100，5%的Tween 20，60， 80。
在20-2000ug/ml浓度范围内有良好的线性关系。
检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。
受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响:EDTA小于10mM。DTT小于1mM疏基乙醇低于1mm。
BCA法和Commassie法各有优势，在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用，以消除定量的误差。
优缺点
操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便;
准确灵敏，试剂稳定性好，BCA 试剂的蛋白质测定范围是20-200ug/ml ,微量BCA测定范围在0.5-10ug/ml。
经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量;
抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响
原理
考马斯亮蓝（CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含
量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比 Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0~1 000ug/ml ,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
优缺点
优点：
灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，蛋白质检测量可达1ug。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质–染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。
测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而*不用像Lowry 法那样费时和严格地控制时间。
干扰物质少。如干扰 Lowry 法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、疏基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
缺点：
由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用v一球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、Triton x-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N 的酸干扰 Lowary法一样)
标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
原理
蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，在最大吸收波长处，吸收光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯-比尔定律，故可作为蛋白质定量测定的依据。
优缺点
优点：方法简单、灵敏、快速、高选择性，且稳定性好，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。
缺点：仪器昂贵，而且不同的蛋白质的紫外吸收是不相同的，测定结果存在着一定的误差，受光源、溶液的PH值、比色皿材质、缓冲介质溶液等因素的影响和限制。
原理
Lowary法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，在加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此，Lowary法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3-15倍，为双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。
优缺点
优点：微克级高灵敏度定量测定，稳定。
缺点：
受植物体内存在的酚类物质干扰。
去污剂如TritonX-100，SDS，NP-40的浓度超过0.2%时会影响定量结果。