6、24、96孔板接种和换液问题

细胞培养板培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等，孔的底部可以选择平的、圆的，或锥形的，这取决于细胞类型和下游应用。对于传统的2D细胞培养(如HeLa或MDCK细胞)，特别是需要对培养物进行成像或分光光度测定，通常选平底(F-bottom)。对于不存在接触抑制的细胞，弧形底(C-bottom)也不错。圆底(U-bottom)适合悬浮培养(如球体细胞培养)，因为圆的表面让细胞难以附着和生长。而锥形底很少用于细胞培养实验，但在细胞沉淀时可能有用。

以下主要为大家介绍6、24、96孔板接种和换液问题。

6孔板接种和换液问题

问题1：细胞传代很正常，但一种到六孔板里(不管加药和对照)，总有两三个孔(随机)细胞长得不好，很小，像破碎了。有人遇到过这种情况吗?到底是啥原因呢?

答：可能跟加液的温度有关。如果细胞刚刚拿出来换液加液，培养基也是从4度冰箱拿出来不久，很容

易细胞就会冻死了。建议最好把培养基先在培养箱里边孵育15min先。

另外，跟细胞的生长状态也有关。加药之前的细胞可以用高点的血清浓度培养。保证细胞状态良好。

或者放在37度水浴锅里孵育也可以，或者是培养板本身的问题，再换换其他培养板试试看。再有可能就是细胞状态问题了，种板时的血清浓度调高试一下。

问题2：用六孔培养板接种细胞，培养24小时后更换培养基，在更换培养基之前，显微镜观察到细胞贴壁，状态非常的好，更换了培养基后，立即用显微镜观察，发现每个孔中都近乎有一半的细胞表现出近乎死亡的状态。细胞变得非常小，产生大量的碎片，而另一半的细胞一切正常，异常细胞与正常细胞之间存在一条分水岭，上半个圆是好的，下半个圆就不好，这是怎么一回事?

答：1.可以看一下是不是培养板没放水平。

    2.培养液如何，如果培养液过期，细胞就不会贴壁。换一点新配制的培养液试一试。

    3.可能是板的问题，换一个牌子的板或换用培养瓶就没问题了。

    4.所需换液的培养板多不多，换培养基的时候如果没有注意风机的影响，特别是所需换液的培养板很多时，容易使细胞因风吹失水而干缩破裂。如果如此，换液时应该逐个培养板进行，别怕浪费吸管，注意操作的效率!

24孔板接种问题

问题1：把细胞消化接种到24孔板之后，已经四天了，老是每孔的中间部分长不满，每天换液时都用PBS 清洗，第二天换液时都出现同样的情况，每孔的边缘长的很好，中央大量死细胞，也不知道是什么原因？

答：是中央长不满，还是中央有和边缘相同密度的细胞，但是大部分都是死细胞?如果是前者，也许不是技术问题，而是物理问题了。

选择孔内铺盖玻片，在玻片上种植。每次换液都用PBS洗，是必要的步骤吗?另外，也有可能和细胞种类有关或者和培养液有关?

如果培养液加的太少了。由于表面张力的作用，培养板的边缘液体会向上走，造成培养液面呈现一个凹面(就像量筒的液体凹面一样)，中央的细胞正好在凹面的Lowest处，培养液少，细胞的营养不够，甚至干涸掉，空气中的氧气也会造成损伤，即使有增值过来的细胞也会死掉。

另外，检查一下培养箱底部的水是否少了，如果少了，箱内的空气湿度不够，会造成培养液挥发加快，这样即使刚加的液体不少，过一段时间，由于蒸发，液体量会减少，造成中央干涸。并且这样会改变了培养液的成分浓度，造成渗透压过高。

个人经验认为这是物理问题：24孔板小，细胞接种进去后是很难摇均匀的，结果导致细胞重贴壁后呈现四周密中间稀的状况。

至于中间较多死细胞，如果是悬浮状的话，也一样是物理问题。接种后比较粗暴的碰撞，似乎对摇均匀细胞有一定效果。

在为多孔板培养的细胞换液时一定要注意，不要把培养基吸得太干，如果全部吸取，很容易造成细胞干涸，这样的话细胞会很快死亡。

同时细胞周围密而中间稀疏，大约有如下原因

1.培养液加得太少。主要是由于液体张力的问题。

2.细胞接种后震荡太厉害了。由于离心力作用导致细胞分布到周围。

问题2：细胞在接种在24孔板上时，孔的周围细胞密集，中间细胞稀少，试了很多次均如此。请问怎样操作才能使细胞分布均匀?

答：这种情况一般是种板时培养液过少，液面总是呈一凹面，如果液面过低，孔中间就基本上没什么细胞，所以种板时一定不能吝啬培养液，待贴壁后可以用比较少量的培养液处理

周围细胞稀少，中间细胞密集:这种情况一般是种板后过于晃动，特别是旋转着晃动.有人才用十字方向的晃动方法使细胞分散均匀.但本公司研究人员认为，将细胞加入孔后，用枪或移液器充分吹打混匀后就不用，也不能再晃动，甚至拿着孔板走路带来的震动都会让细胞往中间集中。

当然，无论是哪种情况，首先都需要保证细胞在种板时时均匀分布的，即种板时的细胞悬液一定要混匀。

根据细胞的特性，细胞均喜欢聚集在边缘生长，所以考虑到，还有可能是接种时的细胞密度不够，导致周边密集，中间稀疏的错觉。

另"要慢慢加样，且记得轻微旋转枪头"。加样不能太快，避免细胞在一个加样处聚集，且注意在不同的部位进行加样，即边加边活动枪头，人为使细胞趋于均匀分布。

96孔板细胞接种换液和收集细胞

问题1：用96孔培养板培养肿瘤细胞，结果细胞长得不是很理想，不是长得不均匀，就是每个孔细胞生长速度不一样。另外，镜下观察细胞轮廓很不清晰，怎么调焦距效果都不好。(板子是刚拆封的。)不知道怎么回事?

答：首先要尽可能把消化细胞消化成单个细胞(不要成团)，反复吹打，掌握好时间(不同的细胞要摸索的)，种细胞时要均匀的吸取，清清的吹打一遍再吸取细胞，这样也许会解决问题。

种到96孔板的细胞一定要消化成单个细胞，建议用EDTA和胰酶消化。加血清后反复吹打。细胞量尽量少一点。

提议：

1、对细胞的选择要注意，要选择状态好的细胞，密度要选分布瓶底80%为宜；

2、消化时，不要忘了用PBS(或纯的不含血清的培养基)洗一遍，加0.25%的胰酶1ml消化2-3分钟(不同的细胞有差别，要摸索)，还要不时的活动，让胰酶分布到每个角落，之后倾去胰酶，加3ml培养基(加血清过于粘稠，不宜吹打，加培养基后稀释胰酶可不考虑对细胞的损伤)，吹打成单个细胞；

3、接种时要注意细胞密度，多数细胞要求0.5-2的10的4次幂，这也要摸索一下(简单：就是种一个密度，如果在测指标时细胞没过多影响结果就行)；

4、周边的孔不要做指标检测孔，有没有发现周边的孔的细胞2天后状态就明显不好了；

5、接种细胞调整好浓度后，要一边吹细胞悬液一边接种；

6、还有看不清细胞，注意到没有，当把培养板拿出孵箱一会，培养板盖就有一层雾，会影响观察细胞，是不是这个问题?

问题2：在96孔培养板上接种的细胞很均匀，但换液时，用枪加150ul的培养基加入每个孔内，结果在显微镜下观察周边细胞全被冲到孔中央去了，而中间的细胞层叠成致密的团块，请问这样的细胞对实验有影响吗?有其他的好办法吗? 是3T3-L1前脂肪细胞，要进行诱导分化成成熟脂肪细胞。所以每次换液总把握不好。请问有谁有这方面的经验吗?

答：我们实验室一般用机械吸引器吸引，吸引器管前面套一个20ul加样器的Tip头，效果不错，操作在无菌台内进行。Tip头剪去Tip后灭菌使用，加液时液体呈滴状滴入，就不会扰动孔底的细胞了。

建议：加液的时候沿着边轻轻的加入，动作柔和，可以避免冲动细胞；去液的时候直接甩板，方便快捷。

去液的时候不建议直接甩板，容易污染。可以剪掉tip尖，不能直接冲细胞，沿孔壁轻轻加入，液体提前在孵箱里预热10分钟，有时候液体凉也会使细胞掉下来。

在96孔板中诱导细胞换液一般采用半量换液，这样细胞就不会被冲走了，至于换液的间隔与细胞有关，如果卷得特别厉害，很可能是细胞的问题，建议更新细胞株。

问题3：细胞对胰酶和EDTA不管用.高浓度胰酶可以，但细胞存活率不高，有没有小的细胞刮匙，(或者自制刮匙的方法)，可以用于96孔板?(在建细胞系，非得用96孔板)。

答：一般情况下细胞在一次性培养瓶或培养板中贴壁较紧，都不太好消化，如果建系的话最好不用刮的方法，还是消化比较好!消化时以下几点注意了吗?

消化前用D-Hanks冲洗了吗?可以冲洗2-3遍。

适当增加胰酶浓度，提高胰酶PH值到8，减少消化时间应该对细胞影响不大。消化时放入37度培养箱。

如果细胞还是消化不下来可加适量胶原酶，有的细胞对胶原酶敏感。

问题4：D-Hanks和PBS冲洗效果有何不同?在胰酶消化前一直用PBS冲洗。

答：首先，D-Hanks和PBS冲洗细胞都可以的，不过严格来说D-Hanks更好，因为胰酶是用D-Hanks溶的，所以用D-Hanks不改变胰酶的消化环境。

第二个问题，可以不用wash，加入带血清的培养基之后胰酶将没有作用，但是如果EDTA浓度太高的话就需要wash了。