大鼠纤连蛋白（Fibronectin）检测试剂盒

本试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法，用于体外定量分析大鼠血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清中Fibronectin的含量。预先包被的抗体为Fibronectin多克隆抗体。检测相抗体也为Fibronectin多克隆抗体，经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的Fibronectin呈正相关。

Fibronectin是细胞外基质中粘附糖蛋白。其表面结构域Arg-Gly-Asp(RGD),可被整合素(integrins)识别，介导细胞粘附。FN参与很多细胞的移动和吸附功能。本试剂盒所用标准品由大鼠血浆提纯，分子量200-250KDa。

检测指标：Fibronectin；纤维连接蛋白
检测范围：156pg/ml～10ng/ml
特异性：系统和其它蛋白质无交叉反应
敏感性：＜15pg/ml

产品组成：

储存条件：2-8℃（频繁使用时），-20℃（长时间不用时）
有效期： 6个月(4℃)；12个月（-20℃）

参考标准曲线数据：(取自某一批次质检数据，仅供参考，用户需要自己建立标准曲线)

大鼠纤连蛋白（Fibronectin）检测试剂盒原理:

问：同一样品多次活性测试结果差异大怎么解决？

答：样本保存不当，会导致多次实验结果偏差较大，样本应尽量减少反复冻融，如需多次检测，需在取样后分装保存。

问：检测样本是细胞培养上清，那么细胞数目对炎症因子的浓度有影响吗？

答：有影响，所以不同样本可以比较的前提条件是培养细胞数水平接近一致。

问：请问标曲是每次都要做吗？

答：是的，每次实验，孵育时间，洗板次数等等条件均不一样，不同实验的标曲不能混用，做一次实验需要做一次标准曲线，并且用当次，同一块板上的标准曲线结果去计算板内样品的浓度，才能得到准确的结果。

问：试剂盒有推荐稀释浓度还需要自己测吗？

答：试剂盒一般会给出不同样品的推荐稀释比例，但是为大致范围，还是根据自己的样本情况，设计预实验测量计算。

问：加完终止液之后测的几次数据差别也蛮大？

答：加完终止液后，显色反应也不是永远停止，形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深，建议在15 min内读数。

问：副孔差别比较大，是没洗干净吗？

答：复孔值差异较大，主要原因应考虑加样是否准确，洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。

问：配好的抗体没用完如何保存，可保存多久？预实验用了一个试剂盒里面的部分板子和试剂，剩下的板子和试剂还能继续用于正式实验吗？

答：一般来讲，配好的母液，可以在四度保存，多一个月左右。剩下的板子和试剂是可以继续用于正式实验的，间隔时间不要太长，一个月之内均可，需注意试剂避免污染，板子保持干燥。

问：后显示的OD值在多少之间属于可用值，有要求吗？

答：有的，建议标准曲线高浓度点的OD值在2.0左右较好，也可参考说明书标曲的数据。

问：样本总是在标准曲线之外，稀释100倍也是，怎么办？

答：在设置稀释倍数之前，需要参考相关文献，对于一些表达*的蛋白，确实会出现这种情况，建议继续提高稀释比例。

问：试剂盒推荐用450和540nm双波长检测，但条件有限可否换成450和620的双波长？如何使用校准波长？还有，用空白孔校准可以么？

答：可以的，TMB底物显色后，吸光峰值在450nm，另外的校准波长是防止气泡等杂质造成的干扰设置，避开450左右50nm以上即可。两次读取的OD值，用OD450 - OD校准波长即可。尽量还是建议有条件的选用双波长校准的方法，因为避免了不同孔的读数影响，防止出现空白孔污染，导致读数较高，无法校准的情况。

问：ELISA可以检测胞内蛋白么？

答：可以的，选用支持组织匀浆的ELISA试剂盒即可，将组织样品或细胞样品进行裂解，提取胞内蛋白后进行蛋白定量，保证每孔上样总蛋白量一致即可。

问：ELISA试剂盒显色液是双组份的，有些其他品牌的是单组分的，使用单组分的有影响么？

答：HRP酶标二抗的ELISA试剂盒，显色底物一般为TMB，TMB不稳定，曝光或污染氧化后会出现显色反应，导致实验背景升高，或无法使用，所以爱必信的ELISA试剂盒将显色液调整为双组份，方便稳定保存，仅在使用前混合，避免了TMB的不稳定影响实验结果。如您选用的试剂盒为单组分显色液，在使用前检测是否为无色透明，如果是正常的，对结果也没有影响，可以放心使用。

问：整个过程需要避光吗？避光需要避到什么程度呢？

答：ELISA实验中，在酶标抗体孵育，以及显色底物孵育这两步建议避光，其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹，或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。

问：标准曲线在推荐的浓度下，r值为0.9，做了多次都是这样，怎么办？

答：要仔细核对产品说明书，看是否用了推荐的拟合方法，如爱必信的ELISA试剂盒，需要使用四参数拟合方式进行拟合，用错拟合方式，会导致r方值较低；如拟合方式无误，需检查是否有个别标曲孔数值异常，排查实验中是否出现污染或倍比稀释时出现失误。

问：封板膜什么时候用？每次加液后都要换吗？

答：封板膜在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体是，都要盖好封板膜，减少挥发及污染几率。每次使用后要更换新的封板膜。

问：手动洗板过程中，拍过抗体或抗原的滤纸需要扔吗？

答：是需要更换的，防止造成交叉污染，影响实验结果的准确性。

问：有的wash buffer析出结晶后在37℃也不溶解，怎么办？

答：可提高至55度，并多次摇晃。溶解后按比例稀释即可使用。

问：测得的值都低于标准曲线的低值，是什么原因，应该怎么解决？

答：原因较多，首先是检查样品是否稀释倍数过高，降低稀释比，直至直接加样本原液，如还检测不出，需排查原因，建议在实验组别设置中添加阳性对照孔，用明确表达的样品作为阳性对照，如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度，则表明实验成功，其余待测样品表达含量低于检测下限，按照0计算即可。这种情况尤其对于炎症因子较为常见，在健康样本中，表达含量极低。

问：因为检测限的原因，同一块ELISA板子，部分样本稀释，部分样本1:10稀释，部分1:20稀释，这样设置可行吗？结果可以比较吗？

答：可以比较，不同稀释比例，是因为不同样本间的表达差异较大，只要保证稀释后的检测样品测量值准确，还原回稀释倍数后的浓度是可信的。可以用来比较不同样本的原始浓度差。

问：试剂盒里面有捕获抗体么？

答：即用型ELISA试剂盒中，捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上，没有单独的捕获抗体提供，直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。

问：ELISA实验中，检测计算抗原的浓度，临界值怎么确定？

答：根据曲线测定的浓度，建议落在标准曲线的中间位置较好，极限不要超过标准曲线的上下限，如果超出较多，会影响计算结果准确性，建议调整稀释比例。

问：In vivo周期长的话，不太好做预实验，怎么办？

答：In vivo造模取样后，可将样品分装，取一部分样品做ELISA预实验，剩余样品再进行正式实验；如多批次实验，操作较为一致，后续可取消预实验，根据前期结果进行ELISA实验浓度设置。

问：做实验前怎么知道待测血清中炎症因子的范围呢？多大是高多小是低？

答：需要根据文献推测，一般在健康人样本中，炎症因子表达很低，接近ELISA检测下限，样品无需稀释或1:1稀释即可，如已知为炎症疾病或造模样本，可参考文献，在预实验中设置1:10-100（或更高）的稀释比例，预实验检测后确定佳浓度进行正式实验。

问：ELISA实验中的洗板步骤如果没有洗板机，需要如何操作？

答：实验室ELISA实验做的较多，还是建议使用洗板机洗板，效果更好，也更方便控制。如果没有洗板机，在洗板过程中，需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出，在加洗板液后，静置1-2min，甩干液体后，在吸水纸上大力拍干；重复三次。

问：ELISA实验中，酶标抗体识别的是哪个抗体？

答：在双抗夹心法ELISA中，酶标抗体识别的是检测抗体，对检测抗体进行识别和酶标记。

问：捕获抗体如何包被在96孔板上？

答：如果选用的是即用型ELISA试剂盒，无需进行抗体包被；如果是非即用型的ELISA试剂盒，首先，要选择ELIS*别的板子，材质应为聚苯乙烯；然后用抗体包被液稀释（pH9.6的碳酸盐缓冲液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl）成工作浓度，然后每孔加100 μl稀释后的捕获抗体，室温或4℃过夜包被，然后进行洗板和封闭之后即可使用，如需长期保存，需要真空冻干后保存

问：ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么？

答：不是的，在双抗夹心法ELISA实验中，会同时用到捕获抗体和检测抗体，这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体，这样才可以同时结合抗原分子。

问： ELISA可以测DNA的表观么？

答：不可以，ELISA是利用免疫学原理，定量检测蛋白质表达的技术。测DNA表观遗传学，主要是检测DNA甲基化，可以选用ChIP技术。