ULTRARIPA® Kit 应用数据
时间：2020-10-16 阅读：1074
◆评价ULTRARIPA® Kit B buffer 单独提取脂筏蛋白的能力
（数据提供：东京大学 大学院药学系研究科 卫生化学教室）
用PBS清洗COS-1细胞后，用SDS buffer、1％ Triton X-100 buffer，ULTRARIPA® Kit A buffer以及ULTRARIPA® Kit B buffer溶解，离心（14,000 rpm, 5 min, 4°C）。分离可溶性组分和不溶性组分。不溶性组分用等量的SDS-PAGE sample buffer变性溶解。通过SDS-PAGE / Western印迹评价脂筏标记物中Flotilin 1的可溶解量。在普通1％Triton X-100和RIPA缓冲液中，大部分的Flotilin 1保留在不溶性膜组分中，然而在ULTRARIPA® Kit B缓冲液中几乎全部溶解了。
各缓冲液的成分：
| ● | SDS buffer（2％SDS, 1％ Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mM NaCl） |
| ● | ULTRARIPA® Kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mM Tris-HCl (pH8.0)，150 mM NaCl，0.5％ Sodium Deoxycholate) |
| ● | ULTRARIPA® Kit B buffer （不公开成分） |
| ● | 1％ Triton X-100 (1％ Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mM NaCl） |
◆用ULTRARIPA® Kit观察NGF刺激依存的Integrin的脂筏转换
（数据提供：国立精神·神经医疗研究中心 神经研究所 疾病研究第五部）
使用的样本：小鼠来源原代培养DRG神经细胞（DIV13，～106 cells/35 mm dish）
目标蛋白：Integrinβ1, Flotillin 1
步骤：
1．在存在和不存在50ng/mL NGF的情况下培养神经细胞（各准备2个样品）
2．用PBS清洗COS-1细胞后，添加150 μL ULTRARIPA® Kit A-buffer，并在冰上孵育
3．离心分离可溶性组分①和不溶性组分
4．准备的2个A-buffer不溶性组分的样品，其中一个管添加150 μL 1× SDS sample buffer使其*溶解②
5．添加150 μL B-buffer至另一管A-buffer不溶性组分中，悬浮沉淀物
6．离心并分离B-buffer可溶性组分③和不溶性组分
7．添加150 μL 1× SDS-PAGE sample buffer至B-buffer不溶性组分中，使其*溶解④
结果：
与NGF刺激中未看到Flutillin的波动相比，观察到了Integrinβ1通过NGF浓缩在RIPA不溶性部分中。
◆使用ULTRARIPA® Kit分析神经突触相关蛋白的可溶性和复合物
（本数据是在Funakoshi与学习院大学理学部 高岛明彦教授，住冈晓夫助教共同研究下取得）
■ 直接添加B-buffer验证溶解效率
使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的P2膜组分*
*P2模组分的回收步骤
从小鼠脑组织切除海马体以及大脑皮质，添加匀浆缓冲液（10 mM HEPES (pH 7.4), 0.32 M Sucrose, protease inhibitors）并用Dounce型匀浆器破碎。
低速（×1,000 g）10分钟离心组织破碎液，去除沉淀的核组分（P1组分）。
上清（S1）组分用中速（×13,200 g）20分钟进一步离心，去除上清（S2）组分，回收沉淀的膜（P2）。
使用缓冲液条件：
SDS：2％ SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl
1％ Triton：1％ TritonX-100, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl ULTRARIPA® Kit
A-buffer(RIPA)：1％ NP-40, 0.5％ deoxycholate, 0.1％ SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl
B-buffer：非公开
步骤：
1． 添加各缓冲液100 mL至P2组分中，在冰上进行超声处理
2． 高速（×100,000 g）离心破碎液，沉淀不溶性组分，回收各可溶性组分
3． 添置100 μL 2% SDS缓冲液至各不溶性组分并使其溶解。
结果：
在经过验证的所有神经突触相关蛋白中，ULTRARIPA® Kit B-buffer的溶解效率比1％Triton X-100和RIPA缓冲液（A-buffer）高。
■ 验证神经细胞膜来源RIPA不溶性组分的B-buffer溶解效率
使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的P2膜组分
步骤：
1． 添加200 μL A-buffer（RIPA）至P2膜组分，在冰上进行超声处理
2． 高速（×100,000 g）离心破碎液，除去可溶性组分，单独分离不溶性组分。
3． 添加200 mL 2% SDS，A-buffer或B-buffer至A-buffer不溶性组分，在冰上进行超声处理
4． 离心（×100,000 g）各溶液，并分离可溶性组分和不溶性组分
5． 为了检测B-buffer不溶性组分中残留的蛋白，添加2% SDS至B-buffer组分中使其*溶解
结果：
发现B-buffer能够溶解神经细胞膜的RIPA不溶性组分中包含的大多数蛋白。
此外，还可以高效提取NMDA型谷氨酸受体亚基的GluN1和GluN2B。
另一方面，尽管PSD 95的可溶性有所提高，但发现它仍残留在B-buffer的不溶性组分中。
■ 使用ULTRARIPA® Kit分析神经突触蛋白复合物
使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的P2膜组分
目标：NMDA型谷氨酸受体NMDAR（GluN1/GluN2B）
AMPA型谷氨酸受体 AMPAR（GluA1/GluA2）
步骤：
| 1． | 添加ULTRARIPA® Kit B-buffer至P2膜组分，在冰上进行超声处理； |
| 2． | 高速离心（×100,000 g）破碎液，获取可溶性组分； |
| 3． | 添加1 μg对照IgG或抗GluN2B抗体或GluA2/3抗体至100 μL可溶性组分，并在4°C下反应1小时后，添 加20μL bed vol Protein A磁珠并反应1小时； |
| 4． | 用PBST（0.05% Tween20 in PBS）清洗磁珠3次； |
| 5． | 添加1×SDS-PAGE样本缓冲液，在100°C加热条件下洗脱。 |
结果：
使用ULTRARIPA® Kit B-buffer，NMDAR，AMPAR都能通过免疫沉淀特异性的检测出复合物。
＊SYN (Synaptophysin)
相关产品信息请点击文字：UltraRIPA 脂筏提取缓冲液套装