富士胶片和光纯药株式会社 生命科学研究所 福地大树

◆前言

      包含疫苗在内的大部分生物药都是使用培养细胞或大肠杆菌生产的，有研究者指出，通过这种方式生产的原料药、制剂可能会残留着宿主细胞来源的DNA。不可否认，宿主细胞或病毒来源的致癌基因很可能会通过这些残留DNA转运过来，或引起病毒DNA感染事件。因此，残留DNA的定量检测是生物制药和其工艺验证中*的一部分。

      有报告建议生物药中每剂量残留DNA的含量不超过100 pg^[1] ，不仅是欧美地区，其他国家也愈发认为必须将定量检测宿主细胞来源的残留DNA作为质量检测项目之一。而检测这种痕量残留DNA，则需要从样品中以高回收率提取痕量残留DNA。

      本文将介绍本公司销售的DNA Extractor^® Kit —— 一款可用于此类痕量残留DNA检测的DNA提取试剂盒。

◆关于DNA Extractor^® Kit

      若要检测、定量生物药中所含的DNA总量，必须先将其所含的DNA从蛋白质等其他活性成分中分离、纯化出来。传统上分离DNA时通常会采用蛋白酶消化样品，然后利用苯酚、三氯甲烷将DNA提取出来的方法。然而，这种方法却有着这些缺点：在获得相对高纯度的DNA的同时，需要使用苯酚、三氯甲烷等有害物质；并且需要花费工夫和时间进行提取操作。而使用二氧化硅等物质作为载体的固相提取方法会因为DNA被吸附到载体上而导致其损耗，因此并不适合用于回收痕量DNA。同样的，使用有机溶剂的方法的痕量DNA回收率也很低，这也是DNA提取试剂的问题之一。

      本公司1992年起推出的DNA Extractor^® Kit（中国药典版本产品编号：292-81101），通过使用NaI法解决了以上问题，只需简易的操作，便可以高回收率提取高纯度的DNA。

◆DNA Extractor^® Kit的原理

      本试剂盒 中包含NaI和表面活性剂，NaI作为蛋白质增溶剂（离液离子），与表面活性剂一同将样品中以蛋白质为主的成分转变为可溶状态，然后通过加入异丙醇，能够选择性地令核酸（主要是DNA）和糖原产生沉淀（即共沉淀）^[2]。如上所述，该试剂盒实现了在不使用固相载体或有机溶剂的情况下，通过简化的提纯步骤获得了沉淀物，以高回收率提取痕量DNA。

※ 本试剂盒组分：NaI溶液、N-月桂酰肌氨酸钠溶液、洗净液（A）、洗净液（B）、糖原溶液

◆使用DNA Extractor^® Kit提取DNA与定量DNA总量案例

      笔者将在下文中重新介绍一次曾刊载于本公司和光纯药时报Vol.60 No,3 p.28（1992）中的案例，该案例报道了关于本试剂盒在存在赋形剂以及添加剂的情况下的DNA加标回收率。在该实验中，分别将通常用作赋形剂或添加剂的物质（精氨酸、尿素等）和蛋白质（BSA（牛血清白蛋白）和人γ球蛋白）以常量或过量溶解于磷酸盐缓冲液中，然后添加pg级的小牛胸腺DNA从而得到模型溶液。

      接下来，按照DNA Extractor^® Kit的实验步骤，对400 µL的每种模型溶液进行DNA提取处理。将所得沉淀物溶解于500 μL的磷酸盐缓冲液中进行阈值法总DNA定量^※[3][4]，测定其DNA的加标回收率。测定结果如表1所示。

表1. 在存在赋形剂以及添加剂的情况下的DNA加标回收率

      我们对5种糖类的不同浓度下的DNA回收率进行了测定，所有DNA加标回收率都在80%~110%范围内。另外，在精氨酸和尿素中也能够以高回收率提取DNA。在蛋白质方面，我们测定了BSA（牛血清白蛋白）和人γ球蛋白，发现两者的DNA回收率都很高。根据样品不同（如蛋白质种类），可能会发生蛋白质沉淀的情况，这种情况下只需稀释或使用蛋白酶处理即可^[5]。从以上结果来看，本试剂盒可对广泛样品以高重复性和高回收率提取残留DNA。

※“阈值法总DNA定量”是指利用Molecular Devices公司的“Threshold^® Total DNA assay system”进行的DNA总量定量的测定方法，是一种不依赖于序列的DNA定量测定方法。

      该方法的总DNA检测灵敏度为2 pg/assay。

◆使用DNA Extractor^® Kit提取痕量残留DNA与通过qPCR法进行定量的案例

      如上所述，“Threshold^® Total DNA assay system”是一种总DNA定量法，并不针对特定序列进行检测。如果希望检测出宿主细胞来源的残留DNA，可以利用qPCR法将特定序列作为检测对象。相对于阈值法的DNA定量，qPCR法有着能更高灵敏度检测残留DNA的这一优点，接下来我们将围绕其能否提取假定宿主细胞来源的痕量DNA进行探讨。

      在本实验案例中，我们将常用于蛋白和抗体生产的CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞系细胞）以及大肠杆菌的基因组DNA作为残留DNA模型，通过提取痕量残留DNA以及以qPCR对其进行定量。实验步骤如图1所示。

图1. 实验步骤

      首先，在100 μL的水（注射用蒸馏水）中添加了0.1 pg～100 pg各基因组DNA的样品，使用本公司的DNA提取试剂盒对上述样品提取DNA，然后将提取的DNA溶解于100 μL的水中。之后采用qPCR，并根据同时值得的校准曲线计算出添加DNA的回收量。结果，大肠杆菌基因组和CHO细胞基因组在0.1 pg～100 pg之间的加标回收率为85～120%（虽未在文中展示数据，但两种基因组在1000 pg以内回收率几乎为100%）。

      接下来，进行模拟细胞培养上清液中含有残留DNA的实验。细胞培养上清液样品通过将0.1 pg CHO细胞基因组DNA添加到500 μL在10％FBS DMEM中培养3天的人胰腺癌细胞系Panc-1的培养上清液中配制而成。结果，根据生成的校准曲线所得的回收量为0.093 pg。通过上述实验证明，使用本试剂盒，即使是500 μL中所含残留DNA仅为0.1 pg（100 fg）的fg级别的痕量DNA也以高回收率进行提取。另外，由于DNA Extractor^® Kit可以以90%以上的高回收率回收存在于水、磷酸盐缓冲液或是细胞培养上清液等样品中的痕量残留DNA（表1表2），因此可以证明本试剂盒的高回收率在不同样品中具有广泛性。

表2. 基因组DNA加标回收率

◆结语

      使用DNA Extractor^® Kit，能够以高回收率回收样品中所含残留DNA。在定量残留DNA时，从样品中提取DNA是十分重要的一个步骤，即便是痕量残留DNA也可以通过本试剂盒进行高回收率提取。另外，由于本试剂盒能够用于广泛的样品，因此我们认为它不仅能用于CHO细胞，还能用于大肠杆菌和酵母等其他宿主细胞来源的残留DNA，有望在生物制药的质控中发挥作用。

◆参考文献

1. Knezevic et al. : Biologicals, 36:203-211(2008).

2. Ishizawa, M et al. : Nucleic Acids Res., 19, 5792(1991).

3. Kung. V. T et al. : Anal. Biochem., 187, 220-227(1990).

4. 水沢左衛子, 本間玲子. : Pharm Tech. Japan, 7, 309-314, 426-431(1991).

5. 和光純薬時報 Vol.61 p.27(1993)

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