包含自革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）在内的热原是可引起发热的物质，也是医药制品中的有害污染物。当医药制品与血液和器官直接接触时，其可能包含的热原会激活人体的先天免疫机制，从而可能导致高烧、炎症、组织损伤、败血症和休克。^[1]因此，为了满足监管要求，医药制品需要进行热原检测，这也是药典规定的标准和质量规格的一部分。^[1]

◆热原的历史背景

1875年，伯顿-桑德森（Burdon-Sanderson）提出了 "热原"（pyrogen）一词，用来描述在腐肉的无菌提取物中发现的一种假设物质，注射后会导致动物发热。1911年，韦赫塞尔曼（Wechselman）发现在注射洒尔佛散（Salvarsan，一种治疗梅毒的药物）时，会因蒸馏水中的细菌导致患者发热，这促使他开始寻找解决方案。然而，洒尔佛散不能口服，只能通过注射起效。因这种注射药物变得普遍，热原控制变得至关重要 ^[2] 。

◆热原检测

家兔热原试验（RPT)

Hort和Penfeld于1912年进行了家兔热原试验，发现革兰氏阴性菌在家兔身上出现明显的热原反应，而革兰氏阳性菌的反应则轻微得多^[2]。在家兔热原试验中，通过给家兔注射热原并记录体温升高的发热反应。但家兔对热原的反应可能与人体的反应具有差异，因此检测存在一定的局限性。

鲎试验法（LAL）

鲎试验法（LAL，也称鲎阿米巴样细胞溶解物检测法）又称细菌内毒素检测法（BET），是一种经济且获得广泛认可的替代方法。鲎试验法通过将鲎血液与细菌内毒素混合，最终形成一种凝胶或显色。目前的鲎试验法试剂盒通过利用这种裂解物的浊度特性或显色特性进行检测。在热原检测方面，鲎试验法的灵敏度已被证明是家兔法的5倍^[3]。

此外，使用氯化钙溶液对放射性药物的鲎试验法进行改良，可避免因螯合剂而导致结果不准确。具体为螯合剂的存在会降低LAL试剂中游离二价钙离子的浓度，从而抑制凝固素凝胶的形成，导致假阴性结果。目前，美国医院和中央放射药房采用这种改良的LAL检测法，用于放射性药物和试剂盒的质量控制检测^[4]。

MAT法（单核细胞活化试验）

MAT法（单核细胞活化试验）可用于识别和定量内毒素和非内毒素热原。热原可激活人体内的单核细胞，从而释放介质^[5]。MAT法通过在体外将人单核细胞暴露于热原从而激活单核细胞，引发促炎细胞因子的释放，随后可使用ELISA技术对其进行定量^[6]。MAT法使用人体细胞，因此更具生理相关性，可以精确地定量识别和检测内毒素和非内毒素热原^[7]。

◆未来展望

从家兔热原试验到MAT法的转变充满挑战，需要付出巨大的努力。欧洲药品质量管理局、欧洲委员会和欧洲动物试验替代方法合作组织共同举办了 "热原性试验的未来：逐步淘汰家兔热原试验 "的国际会议，会议重点讨论了2026年前从欧洲药典中删除家兔热原试验、高效推动MAT法应用的使命，并指出在淘汰家兔热原检测方面还存在的差距^[8]。

此外，为符合FDA指南，使用MAT法前必须执行特定于产品的验证，以确认使用MAT法评估特定检测物质或材料的适用性。验证过程应包含对每个样品进行干扰试验和精确热原检测等多种测试，同时还需要保证设备与单核细胞之间的直接接触^[9]。

参考文献

1.  Spoladore, J., et al., Standardized pyrogen testing of medical products with the bacterial endotoxin test (BET) as a substitute for 

     rabbit Pyrogen testing (RPT): A scoping review. Toxicol In Vitro, 2021. 74: p. 105160.

2. Hartung, T., The human whole blood pyrogen test – lessons learned in twenty years. ALTEX - Alternatives to animal experimentation, 

    2015. 32(2):p. 79-100.

3.  Karesh, S.M.J.J.o.n.m.t., Sterility and pyrogen testing of radiopharmaceuticals. 1989. 17(3): p. 156-159.

4.  Mitra, A., et al., Limulus amebocyte lysate testing: adapting it for determination of bacterial endotoxin in 99mTc-labeled 

    radiopharmaceuticals at a hospital radiopharmacy. J Nucl Med Technol, 2014. 42(4): p. 278-82.

5.  Solati, S., T. Zhang, and S. Timman, The monocyte activation test detects potentiated cytokine release resulting from the synergistic

     effect of endotoxin and non-endotoxin pyrogens. Innate Immun, 2022. 28(3-4): p. 130-137.

6.  Perdomo-Morales, R., et al., Monocyte activation test (MAT) reliably detects pyrogens in parenteral formulations of human serum

     albumin. Altex, 2011.28(3): p. 227-35.

7.  Carson, D., et al., Development of a Monocyte Activation Test as an Alternative to the Rabbit Pyrogen Test for Mono- and Multi-

    Component Shigella GMMA-Based Vaccines. 2021. 9(7): p. 1375.

8.  Cirefice, G., et al., The future of pyrogenicity testing: Phasing out the rabbit pyrogen test. A meeting report. Biologicals, 2023. 84: p.

    101702.

9. Sandle, T., FDA guidance on pyrogens and endotoxin testing.

相关产品

点击此处查看相关产品：重组级联试剂PYROSTAR™ Neo＋