中检所的微生物验证范例

复方磷酸可待因（欧博士止咳露）溶液微生物限度检查法验证实验


1. 样品复方磷酸可待因（欧博士止咳露），批号309315 、402021，生产厂家为香港欧化药业有限公司。
2. 验证用菌种 枯草杆菌CMCC（B）63501、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC (F) 98001、 黑曲霉CMCC(F)98003。
3. 方法 中国药典有关微生物限度检查法方法验证试验。 
4. 具体操作方法
4.1菌液制备：
(1) 取经37℃培养18~24h，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml盐水，10倍稀释至10-5 ~10-7，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
(2) 经25 ℃培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml+9 ml盐水10倍稀释至10-5 ~10-7，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
(3) 取经25 ℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3~5ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 用标准比浊管比浊，然后取1 ml +9 ml盐水，逐管10倍稀释为10-4，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
4.2 供试液制备 吸取样品10 ml ，加0.1%蛋白胨水氯化钠稀释液90ml浓度均为1：10供试液，分别人工污染上述5种代表试验菌株。
4.3 培养基稀释法： 采用加0.5 ml、0.2 ml、0.1 ml /皿供试液，再加15~20 ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~48小时观察结果细菌计数，测定回收率。结果见表：
4.4 回收率测定：
(1) 试验组: 分别取不同品种的1：10供试液1 ml、50~100个/ ml 试验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。薄膜过滤法以zui后一次的冲洗液加入试验菌.
(2) 活菌组 测定每一菌株的试验菌数
(3) 供试液对照 测定供试品本底菌数
(4) 稀释剂对照组
5 结果
菌落计数结果、常规法和培养基稀释法在复方磷酸可待因微生物限度检查法的验证结果见表1、2和表3。
表1 菌落计数（cfu/ml） 
实验次数 金葡菌10-5 枯草杆菌10-5 白色念珠菌10-5 黑曲霉10-4 大肠埃希菌10-7
1 94、90 130、80 73、72 110、90 14、15
2 80、74 45、 23 128、108 110、120 54、34
3 153、150 78、 77 73、74 110、100 30、27
从表2结果可以看出: （1）采用常规方法检验复方磷酸可待因溶液供试品，人工污染5株代表菌株，该供试品对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率试验均高于70%，可采用常规方法检验。（2）复方磷酸可待因对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有不同程度的抗菌活性，供试品回收率为0.02~29.2%，均低于70%。
表2 复方磷酸可待因微生物限度检查方法验证 （常规法） 
实验次数 人工染菌回收率%
金葡菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 大肠埃希菌
1 0.02 71.4 81.1 100.0 100.0
2 29.2 29.4 100.0 100.0 100.0
3 抑菌 抑菌 100.0 100.0 100.0

表3 培养基稀释法（1ml加2个平皿）复方磷酸可待因微生物限度检查验证 
实验次数 人工染菌回收率%
金葡菌 枯草杆菌
1 80.7 100.0
2 91.4 100.0
表3中的结果证明，采用培养基稀释法可消除供试品对人工污染金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑菌作用。回收率达到70%以上。因此，培养基稀释法（0.5ml/皿）可用于复方磷酸可待因（欧博士止咳露）的微生物限度检查。
6 结论
根据验证试验结果，确定复方磷可待因（欧博士止咳露）溶液微生物限度检查法为细菌数测定可采用培养基稀释法（0.5ml/皿）测定，霉菌数可采用常规法测定。
注：常规法为1ml供试液加15~20ml菌落计数用培养基；培养基稀释法则为0.5ml供试液加15~20ml菌落计数用培养基为2倍稀释，0.2ml供试液加15~20ml菌落计数用培养基为5倍稀释。