RT Primer的佳选择

通常RT primer可分为三类：oligo dT，随机引物以及基因特异性引物。Oligo dT引物之所以应用范围更加广泛，是因为可由此获得mRNA的全长拷贝。

然而如果mRNA长度过长>4kb，或者没有polyA尾（原核mRNA或rRNA），就需要考虑使用随机引物进行RNA的反转录。随机引物虽能长基因的5’末端的转录，但并不能获得整个基因全长的cDNAs，且对RNA样品质量要求比较高，此时可用6-8个核酸聚合体来提高cDNAs的合成量。

而对于真核生物的qPCR，长随机引物和Oligo-dT引物的混合物似乎能给出一个漂亮的结果。针对此类优化混合引物，已有两家公司的试剂盒或可助大家一臂之力：Qiagen QuantiTect Rev. Transcription Kit和BioRad iScript Kit。

第三个选择就是基因特异性引物，仅扩增需要的cDNA，适用于目的序列已知的情况。通常在一步RT-PCR法中可使用此类引物，因为该引物也可用作为PCR中的反向引物。

RNA的二级结构

若要获取全长RNA的反转录，那么RNA二级结构的问题就不可忽略，因为反转录酶在遇到此类结构后会终止反应或从模板上脱落下来。

也许你很难判断RNA是否具有二级结构，但如果基因中GC含量较高，通常意味着RNA很难被变性且不可能是单链，此时就需要在65℃ 5min对其进行充分变性，以避免其对实验结果的影响。

另外，还有一种方法可解决此问题，即使用一种适温度高于正常标准（37℃-42℃）的逆转录酶。比如来自Life Technologies的Themoscript酶就常用于具有复杂结构RNA的逆转录。当然也存在一些即使在常规逆转录温度（37℃-42℃）的条件下，也能跨过RNA二级结构的率逆转录酶，即使是针对富集GC序列的RNA也能得到很好的结果，如Qiagen公司的逆转录酶Omniscript和Sensiscript，以及Takara Bio公司的PrimeScirpt RT enzyme。

去除gDNA

RNA中存在的基因组DNA（gDNA）污染可能是终PCR反应中假阳性结果出现的原因，目前已存在很多方法去除gDNA，比如通过DNAase对提取的RNA进行预处理。

以上方法无可避免会造成RNA的蛋白污染，因而这里介绍一种可绕开酶处理的方法，即针对RNA设计一种包含内含子或内含子-外显子边界的引物，如此DNA就不会产生扩增抑或即便扩增了其条带大小也与cDNA不同。

但值得注意的是，使用该方法时基因中要没有假基因存在，假基因（pseudogene）是插入到基因组中剪切mRNA的DNA拷贝，否则也会产生假阳性结果。

而对于没有内含子的原核RNA，gDNA的去除则更是基因表达准确测量的一个至关重要的因素。使用DNAase处理RNA是*的方法，Quantitect Rev.Transcription Kit中所包含的gDNA清除缓冲液就可在无需加热或EDTA失活的条件下降解DNA。此外，具有gDNA Eraser（Takara Bio）的PrimeScript RT试剂盒也可去除gDNA，且能在不到20分钟之内快速完成RNA的cDNA合成。

检测RNA分子的完整性

毫无疑问，RNA质量对cDNA合成结果会产生重要的影响，而不同批次间RNA质量差异也导致RT-PCR产生不同的结果。所以在进行RT-PCR前，应该检查RNA条带的质量，可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。通常完整的真核RNA应包括28S和18S RNA条带，且较大的条带的强度应是较小条带的两倍左右，另外两个条带强度大致相同也是可以的。

而另一种准确测量RNA质量的方法是使用Agilent BioAnalzyer仪器，它可将RNA分子可视化并能在分析RNA完整数值（RNA Integrity Number，RIN）后给出一个质量的量化标准。RIN为8-10，则表示RNA质量非常好；当RIN值低于7，则说明RNA可能有降解，可能会导致一些罕见信息的丢失等问题。RNA定量

除了掌握RNA的完整性之外，准确评估产量也很重要。产量的准确性会受到以下因素的影响：测量仪器的准确性、DNA的污染、盐的污染以及降解程度。而为了准确测量产量，小编我更喜欢使用Nanodrop进行UV定量。

该仪器不需要稀释样品，并且具有非常宽的测量RNA的范围。以小编的经验，它可以准确读取到10ng / ul。而传统的紫外分光光度法应避免使用大容量的比色皿，因为这需要耗费大量的样品。此法的缺点是也可在样品中测量基因组DNA，如果从RNA提取过程残留盐或酚，则会增加吸光度，使得RNA的OD值变得更高。

而解决此问题一个方法是使用荧光染料，Ribogreen是一种RNA特异性染料，可通过荧光来测量RNA产量。现在，Nanodrop已经具备检测Ribogreen所发出荧光的功能。

两步法或一步法RT-PCR

RT-PCR也分两种类型：一步法（One-step PCR）和两步法（Two-steps PCR），具体操作见下图。前者，RT反应和PCR扩增是在同一个反应管中进行的；而后者，RT 反应与PCR扩增反应单独进行。

尽管这两种方法都能得到终的结果，但是每种方法都有优缺点。选择哪种方法取决于各种因素。如下总结它们的优缺点。

一步RT-PCR消除了样品转移步骤，不仅消除了控制物污染的潜在来源，而且需要较少的准备和操作时间。又因一步RT-PCR中所使用的引物是基因特异性的，灵敏度高，常用于分析低表达水平基因。而其不足在于同一样本中只有有限数量的目的基因被扩增，且需要在转录和扩增间寻找一个平衡。

所以当时间对实验很重要时，一般采用一步法，如检测RNA病毒，也适用于高通量分析。由于该法的检测结果准确率高，因而在需要测量表达水平上的细微差异时，也可采用此方法。

而两步RT-PCR可将大批量的RNA转化为cDNA，然后储存cDNA用于后续实验，可检测大量基因；在分别优化RT和PCR步骤后，可更好地控制实验过程；又因只有少量的转录本被用于PCR，则可能从RNA 分离到RT反应的抑制剂（如乙醇、酚及胍盐等）都被稀释了。

但是两步RT-PCR更耗费时间，且带来污染的可能性更高；RT过程应以相同效率反转录RNA，否则会影响qPCR的启动效率，进而带来不同的实验结果，因此对于每个RT反应应使用相同的条件。

如果你需要对同一样本的多个目标进行分析时，可选择两步RT-PCR。另外，当RNA的存储是个问题时,好是进行两步RT-PCR，因为cDNA在-20℃是稳定的。