SPE应用一：兽药残留应用
时间：2017-10-23 阅读：4915
动物组织中盐酸克仑特罗等4种β-激动剂药物残留检测（Cleanert PCX, P/N: CX1506）
1.实验材料
1.1 固相萃取小柱：PCX(150mg/6mL)
1.2 四种β-激动剂药物：盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗、莱克多巴胺等4种β-激动剂药物。
2. 试料的制备
取空白样品，经过液液萃取初步处理后，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。
3. 净化
依次用甲醇5mL、水5mL和30mmol/L盐酸5mL润洗固相萃取小柱，将上述备用液过柱，依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，真空抽干，用4%氨化甲醇5mL洗脱PCX小柱，收集洗脱液于具塞玻璃试管中，50℃下氮气吹干。在样液过柱和洗脱过程中流速控制在1mL/min左右。
4. 衍生化及检测
将上述盛有残渣的具塞玻璃试管放入50℃烘箱中加热片刻，除去水分后，加入甲苯100mL和双*基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）100mL，涡旋振荡20s，密封玻璃塞，置于80℃恒温烘箱中加热l小时，冷却后加入300mL甲苯，作为试样溶液，供气相色谱-质谱分析。
5. 结果
5.1 回收率实验（精密度和准确度）
将猪肝空白样品经过液液萃取初步处理后，分别添加一定量的标准溶液，配制1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L和100μg/L五个浓度的试样溶液，每批次内同一浓度做5次平行实验，共4个批次（样品典型回收率色谱图见附图）。
猪肝中实验结果列表如下
添加浓度 （μg/L） | 回收浓度 （μg/L） | 平均回收值 （μg/L） | 平均回收率 （%） | 相对标准偏差 （%） |
1 | 0.75 | 0.72 | 72.40 | 5.93 |
0.67 | ||||
0.72 | ||||
0.70 | ||||
0.78 | ||||
2 | 1.62 | 1.63 | 81.30 | 1.23 |
1.66 | ||||
1.60 | ||||
1.61 | ||||
1.64 | ||||
5 | 4.02 | 4.24 | 84.80 | 4.16 |
4.10 | ||||
4.27 | ||||
4.38 | ||||
4.43 | ||||
10 | 8.24 | 8.45 | 84.45 | 2.81 |
8.35 | ||||
8.77 | ||||
8.62 | ||||
8.25 | ||||
100 | 90.24 | 9.12 | 91.15 | 2.86 |
87.15 | ||||
91.77 | ||||
92.62 | ||||
93.95 |
5.2重复性实验（批间误差实验）：
猪肝中实验结果列表如下
批间 | 添加浓度（μg/L） | |||||||||
1 | 2 | 5 | 10 | 100 | ||||||
平均 回收率% | RSD% | 平均 回收率% | RSD% | 平均 回收率% | RSD% | 平均 回收率% | RSD% | 平均 回收率% | RSD% | |
1 | 72.40 | 5.93 | 81.30 | 3.49 | 84.80 | 6.16 | 84.45 | 3.59 | 91.15 | 2.86 |
2 | 75.37 | 6.12 | 80.47 | 5.37 | 84.74 | 7.55 | 87.46 | 4.68 | 90.05 | 3.86 |
3 | 70.09 | 7.85 | 80.80 | 6.57 | 83.10 | 8.17 | 83.21 | 5.39 | 89.53 | 4.16 |
4 | 76.73 | 4.90 | 78.50 | 8.35 | 82.90 | 5.11 | 85.95 | 5.72 | 88.27 | 5.93 |
平均值 | 73.65 | 6.20 | 80.25 | 5.95 | 83.88 | 6.75 | 85.27 | 4.84 | 89.75 | 4.20 |
RSD% | 12.95 | 10.79 | 9.43 | 7.00 | 5.75 | |||||
附图：猪肝中0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L和100μg/L六个浓度检测结果总离子流图（TIC）代表图谱：
liver+1ppb(pcx)
猪肉中五种磺胺药物的检测（Cleanert SUL-5, P/N: SUL-5）
一、实验材料
1．SPE柱：Cleanert SUL-5（2g/10mL）
2．五种磺胺类药物：磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲唑(SMZ) 、 磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺喹啉(SQ)
3．标准样品工作液
标准样品根据NY 5029-2001附录E配制，浓度为10mg/kg。
二、实验过程
1.柱保留回收率实验方法
按照NY 5029-2001附录E中的方法进行柱保留实验。具体步骤为：吸取50µL或100µL混合标准工作液于2.95mL或2.90mL95%乙腈中溶解，然后过已经5mL95%乙腈活化的SUL-5小柱。具体步骤如下：
1）柱平衡：95%乙腈5mL
2）上样（95%乙腈样品溶液 3mL）
3）预淋洗：5mL95%乙腈淋洗
4）洗脱：70%乙腈10mL洗脱
收集洗脱液，进行HPLC分析，进样量为20µL。
2.添加回收率实验
按照NY 5029-2001附录E中的方法进行添加回收率实验。具体步骤为：称取组织样品5g（到0.01g）于已加有10g无水硫酸钠的离心管中，然后加入乙腈25mL，,以10000r/min以上的速度均质1min后，以3000r/min的速度离心5min。分离后的残渣再用25mL乙腈处理，以3000r/min的速度离心5 min。合并两次的上清液，加入用正己烷30mL，振荡10min，以3000r/min的速度离心5min，取下层液体，加正丙醇10mL，50℃下减压干燥至干，残留物用95%乙腈3mL溶解，过碱性氧化铝小柱。用95%乙腈5mL过柱，不收集，再用70%乙腈10mL洗脱后，收集洗脱液进行液相色谱仪测定。
3．实验结果与分析
3．1 柱保留回收率实验
对Cleanert SUL-5小柱分别进行了两种浓度的柱保留回收率实验，浓度设置相当于实际样品中含有100µg/kg和200µg/kg磺胺类药物，实验结果见表1、表2，从表中可见Cleanert小柱SM2、SMM、SMZ、SDM和SQ的平均回收率范围分别为92.47~99.37%、93.69~99.44%、88.61~96.27%、90.87~96.06%和91.83~95.92%，效果良好；同样从表中可见Cleanert小柱的批内变异系数在0.30~9.38%之间，小柱的稳定性较好。
3．2 样品回收率实验
对Cleanert SUL-5小柱进行了两个浓度的回收率实验，每个浓度6个重复，结果见表3。从表3可知Cleanert小柱在100µg/kg和200µg/kg添加浓度下，猪肉中的平均回收率在80.62~94.49%范围内，批内变异系数在3.98~7.79%范围内，回收率高，稳定性好。
表1. Cleanert小柱保留回收率实验结果(浓度相当于组织中100µg/kg)
小柱批次 | 药物种类 | 回收率(%) 平均回收率 (%) RSD(%) |
*批
第二批
第三批 | SM2 SMM SMZ SDM SQ SM2 SMM SMZ SDM SQ SM2 SMM SMZ SDM SQ | 94.37 96.10 95.19 95.22 0.91 96.97 95.38 96.10 96.15 0.83 89.95 90.96 98.50 93.14 5.01 94.66 98.15 95.08 95.96 1.99 93.48 91.85 90.55 91.96 1.59 94.18 95.49 101.13 96.93 3.81 97.55 88.94 96.90 94.46 5.07 91.73 87.87 94.46 91.35 3.62 87.22 99.60 97.87 94.90 7.06 92.18 94.80 93.17 93.38 1.43 95.08 94.76 94.52 94.79 0.30 99.63 95.11 95.96 96.90 2.48 96.40 98.16 87.26 93.94 6.23 96.79 96.66 94.55 96.00 1.31 96.32 91.38 92.49 91.93 0.85 |
表2. Cleanert小柱保留回收率实验结果(浓度相当于组织中200µg/kg)
小柱批次 | 药物种类 | 回收率(%) 平均回收率 (%) RSD(%) |
第三批
第四批
第五批 | SM2 SMM SMZ SDM SQ SM2 SMM SMZ SDM SQ SM2 SMM SMZ SDM SQ | 99.66 99.26 98.75 99.22 0.46 97.46 100.25 96.37 98.03 2.04 96.35 94.42 97.06 95.94 1.42 94.97 94.86 98.34 96.06 2.06 98.22 91.96 97.59 95.92 3.59 100.45 85.90 91.06 92.47 7.97 94.67 88.58 97.83 93.69 5.02 95.96 81.25 88.63 88.61 8.30 99.83 82.87 89.90 90.87 9.38 96.21 87.89 91.40 91.83 4.54 98.69 100.31 99.11 99.37 0.85 101.51 100.78 96.04 99.44 2.99 91.35 98.78 98.68 96.27 4.43 92.75 97.29 97.88 95.97 2.92 84.27 98.61 98.20 93.69 8.71 |
表3. Cleanert小柱猪肉样品回收率实验结果
添加浓度（µg/kg） | 药物种类 | 回收率(%) 平均回收率 (%) RSD(%) |
100
200 | SM2 SMM SMZ SDM SQ SM2 SMM SMZ SDM SQ | 93.39 97.95 98.87 90.33 98.27 88.14 94.49 4.83 97.46 90.66 94.33 81.83 93.64 96.50 92.40 6.17 83.78 88.45 94.40 80.24 82.04 80.30 84.87 6.56 91.26 96.75 91.79 87.57 85.88 88.43 90.28 4.30 88.44 85.14 92.61 81.03 79.57 83.59 85.06 5.69 80.85 77.37 88.39 90.53 73.80 81.17 82.02 7.79 91.79 88.87 96.23 92.96 87.01 87.36 90.70 3.98 79.60 77.27 87.34 86.98 75.44 82.47 81.52 6.09 84.31 72.35 84.52 81.92 82.53 78.10 80.62 5.79 91.93 81.86 91.83 87.89 86.90 86.17 87.76 4.33 |
水产品、进口肉中土霉素、四环素、金霉素含量检测方法（Cleanert PS, P/N: PS2003）
1．SPE柱：Cleanert PS柱（200mg/3mL）
2．样品处理
称取5g经匀浆处理的样品于100mL离心管内，分别加入含有EDTA2Na的柠檬酸缓冲液30mL、20mL，混合震荡提取，合并上清液。加入20mL正己烷和上清液于分液漏斗中，充分混合震荡5min，合并下层。
含有EDTA2Na柠檬酸缓冲液的配制：取0.1mol/L柠檬酸缓冲溶液307mL和0.5mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液193mL混合均匀，向其中加入1.86gEDTA2Na，溶解后作为样品提取液。
3．净化步骤：
以10mL甲醇，10mL水，5mL EDTA2Na活化PS柱，加入上清液，然后以10mL水淋洗小柱，抽干，zui后以10mL甲醇洗脱目标物，并收集。
4．浓缩及定容：
浓缩：在旋转蒸发仪上减压浓缩，温度小于40℃
定容：加入1.0mL的1.36%的磷酸二氢钾溶液，将定容液进行HPLC分析
5．HPLC条件
色谱柱：Venusil MP C18, 5µm,4.6*250mm
流动相：A:B=77:23
A：咪唑缓冲液—称取68.08咪，10.72乙酸镁，0.37EDTA2Na 溶于800mL水中，用冰乙酸调pH到7.2，加水定容到1000mL.
B：乙腈
6．结果：（两个平行）
名称 | 回收率-1 | 回收率-2 |
土霉素 | 128% | 137% |
四环素 | 91.8% | 97.4% |
金霉素 | 88.5% | 87.1% |
强力霉素 | 97.3% | 95.3% |
蜂蜜中四环素检测（Cleanert PEP,Cleanert COOH,P/N：PE5006,CH5003）
- 样品制备：称6g蜂蜜样品+30mL提取液（PH=4.0），旋涡振荡
提取液配制：柠檬酸10.5g+磷酸氢二钠（无水）8.88g+乙二胺四乙酸钠30.3g+820mL水，用2M HCl调PH至4.0）
2．SPE步骤
① PEP(500mg/6mL)
活化：甲醇，水
上样：把样品提取液过柱
淋洗：5%甲醇/水 5mL,抽干
②COOH(500mg/3mL)
活化：乙酸乙酯，2柱管
③PEP（上）-COOH（下） 串联
淋洗： 15mL乙酸乙酯淋洗，拿下PEP柱，COOH柱抽干（5min）
洗脱： 流动相（0.01M草酸：乙腈：甲醇=350：100：50）4.5mL
定容： 洗脱液用0.01M草酸定容至5mL,摇匀，过滤膜，UPLC测定。
硝基呋喃类代谢物残留量的LC/MS测定方法 (Cleanert PEP，P/N:PE0603)
1．材料：SPE柱：PEP(60mg/3mL)
2．样品制备
2．1 奶粉和牛奶样品处理
2.1.1 样品处理：奶粉1g(牛奶称5g)，加15 mL三氯乙酸-水混合溶液（2+1，5mol）,加内标，加混标，37.5℃水浴水解5小时，取出后4000 rpm离心5min，取上清液待用。
2.1.2 样品初步净化及衍生：PEP柱以5mL甲醇，5mL水活化，后把2.1.1处理好的上清液过柱，待样液全部通过固相萃取柱后用5ml的三氯乙酸淋洗全部收集到另一个管中，加100μl衍生剂(20mg而硝基苯甲醛溶于1ml二甲亚砜)，放入37.5℃水浴中衍生16小时（过夜）。
2．2 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品和蜂蜜样品处理
2.2.1样品粗处理：猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品称2g（蜂蜜称5g），加入15mL甲醇-水混合溶液（2+1），涡旋，混匀， 4000 rpm离心5min，吸取上清液，加入内标及混标。
2.2.2 衍生：在上述上清液中加100μL衍生剂(20mg而硝基苯甲醛溶于1mL二甲亚砜)，放入37.5℃水浴中衍生16小时（过夜）。加磷酸氢二钾缓冲液5mL（pH约为7.4），4000 rpm离心10 min，（若待测样品含脂肪较多，上清液加5 mL正己烷，振荡2 min，4000 rpm离心10 min吸取并弃掉正己烷）
3．PEP柱净化
1) 活化：PEP柱以5mL甲醇，5mL水活化
2) 上样：将2.2.1或2.2.2中的衍生液加磷酸氢二钾缓冲液5ml，用1mol/l氢氧化钠溶液调节溶液pH约为7.4，4000 r/min离心10 min，上清液（若待测样品含脂肪较多，上清液加5 mL正己烷，振荡2 min，4000 r/min离心10 min吸取并弃掉正己烷）以小于2 mL/min的流速通过PEP柱
3) 淋洗：以10 mL水洗涤固相萃取柱，弃去全部流出液。用真空泵在65 kPa负压下抽干PEP固相萃取柱15 min。
4) 洗脱：用5 mL乙酸乙酯洗脱被测物于25 mL棕色离心管中。
5) 浓缩：洗脱液在40℃水浴中氮气吹干，用样品定容液溶解并定容至1.0 mL，混匀后过0.2μm滤膜用液相色谱-串联质谱测定。
动物性食品中糖皮质激素类药物多残留LC/MS检测方法 (Cleanert Silica, P/N:SI5006)
1．固相萃取柱：Cleanert Silica，500mg/6ml
2．提取
2.1肌肉组织样品
称取组织试料5g（±0.05g）于50mL离心管中，加30mL乙酸乙酯, 10g无水硫酸钠，均质1min，200r/min摇床振动20 min，4200r/min离心10min,移取乙酸乙酯层。残渣中加乙酸乙酯25mL, 均质1min，200r/min摇床振动20 min，4200r/min离心10min,移取乙酸乙酯层。合并两次提取液，40℃旋转至近干，加乙酸乙酯1mL和正已烷5mL,溶解残渣,待净化。
2.2 牛奶、鸡蛋样品
称取牛奶或鸡蛋试料5g（±0.05g）于50mL离心管中，加30mL乙酸乙酯,均质1min，200r/min摇床振动20 min，4200r/min离心10min,移取乙酸乙酯层。残渣中加乙酸乙酯25mL，均质1min，200r/min摇床振动20 min，4200r/min离心10min，移取乙酸乙酯层。合并两次提取液，40℃旋转至近干，加乙酸乙酯1mL和正已烷5mL,溶解残渣,待净化。
3．净化
用正已烷6mL活化Silica柱，提取液过柱。用正已烷6mL淋洗萃取柱，抽干，用正已烷-丙酮(6/4,V/V)6mL洗脱。洗脱液50℃氮气吹干，加20%乙腈水溶液0.5mL,溶解残渣，转入1.5mL离心管中，4200r/min离心20min，取上清液，过0.22um滤膜，供液相色谱-串联质谱法测定。
动物源食品中玉米赤霉醇类药物残留LC/MS检测 (Cleanert NH2, PAX, P/N:NH5006, AX1506)
1.SPE柱：Cleanert NH2:500mg/6mL, PAX: 150mg/6mL
2.样品处理
2.1肌肉组织样品
2.1.1 提取：称取5g（±0.05g）于50mL离心管中，加甲醇15mL,涡旋1min,4000r/min离心10min,取上清液于另一离心管中。重复提取一次，合并两次提取液。加正已烷20mL,手摇20次，3000r/min离心5min,弃上层正已烷。再加正已烷20mL重复脱脂一次。下层转至100mL鸡心瓶中，50℃旋蒸至近干，加乙酸乙酯5mL,涡动1min,静置10s,上清液转移至同一个离心管。再用正已烷10mL洗涤鸡心瓶一次，合并三次残余物溶解液，备用。
2.1.2净化：氨基柱上加无水硫酸钠2g，用玻璃棒敲匀。依次用乙酸乙酯和正已烷各5mL活化，取备用液全部过柱，再依次用正已烷、正已烷-乙酸乙酯(60+40,v/v)各5mL淋洗。依次用正已烷-乙酸乙酯（20+80，V/V）和乙酸乙酯各4mL洗脱，合并两次洗脱液，50℃氮气吹干。
2.1.3净化：残余物中加乙腈0.5mL,涡动1min，加水0.5mL,混匀，过0.2um有机滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
2.2 肝脏组织样品
2.2.1 称取5g（±0.05g）于50mL离心管中，加甲醇10mL,涡旋1min,4000r/min离心5min,取上清液于另一离心管中。重复提取一次，合并两次提取液。加正已烷10mL,手摇20次，3000r/min离心5min,弃上层正已烷。下层于50℃氮气吹干，加乙酸乙酯5mL,涡动1min,再加正已烷20mL涡动30s, 4000r/min离心5min,取上清液备用。
2.2.2 净化：氨基柱上加无水硫酸钠2g，用玻璃棒敲匀。依次用乙酸乙酯和正已烷各5mL活化，取备用液全部过柱，再依次用正已烷、正已烷-乙酸乙酯(45+55,v/v)各5mL淋洗。依次用正已烷-乙酸乙酯（20+80，V/V）和2%甲醇乙酸乙酯各5mL洗脱，合并两次洗脱液，50℃氮气吹干。
2.2.3净化：残余物中加乙腈0.5mL,涡动1min，加水0.5mL,混匀，加正已烷2mL,涡动30s,9000r/min离心5min,取下层清液，过0.2um有机滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
2.3 牛奶样品
2.3.1 提取：量取5.0mL试料于50mL离心管中，加18%的硫酸溶液0.1mL,涡匀，静置10min,加正已烷10mL和乙腈20mL，300r/min振荡10min，4000r/min离心10min，弃正已烷层。取提取液12.5mL于离心管中，50℃氮吹至小于0.1mL。加水10mL,用5mol/lNaOH调节Ph值至11，9000r/min离心5min,备用。
2.3.3 净化：Cleanert PAX固相萃取柱依次用甲醇、水各2mL活化和平衡，将备用液过柱，依次用甲醇-氨水-水（5+5+90,V/V/V）1mL和甲醇0.5mL洗涤，用2%乙酸乙腈4mL洗脱，收集洗脱液，50℃下氮气吹干。
2.3.3净化：残余物中加乙腈0.5mL,涡动1min，加水0.5mL,混匀，过0.2µm有机滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
2.4 鸡蛋样品
2.4.1提取：称取5g（±0.05g）于50mL离心管中，加乙腈10mL,涡动1min,9000r/min离心5min，取上清液于另一立新观众。重复提取一次，合并两次提取液。取12.5mL于离心管中，50℃氮吹至小于0.1mL。加水10mL,用5mol/lNaOH调节Ph值至11，9000r/min离心5min，备用。
2.4.2净化：Cleanert PAX固相萃取柱依次用甲醇、水各2mL活化和平衡，将备用液过柱，依次用甲醇-氨水-水（5+5+90,V/V/V）1mL和甲醇0.5mL洗涤，用2%乙酸乙腈4mL洗脱，收集洗脱液，50℃下氮气吹干。
2.2.3净化：残余物中加乙腈0.5mL，涡动1min，加水0.5mL,混匀，过0.2µm有机滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。