筛选稳定细胞株的两种方法
时间：2021-08-24 阅读：2342
1.单克隆环法主要用于整合率低的转染法以及获得单克隆细胞株。单克隆环法具有工作量小的优点，只要把转染体细胞按一定的细胞密度放入新的培养皿，用合适的药物筛选并在培养皿中进行扩增，适合少量劳动力作业，其劣势可能难以获得高产率的稳定株。
2.逆转录病毒的混合克隆技术筛选：
此法可用于制备稳定混合细胞株，其优点在于能在短时间内得到稳定的胞株，且能在任何时候将细胞稀释成新的培养皿，倾向于整合靠近转录始端的位点的基因，容易激活下游基因，但同时这些整合到转录活性基因的基因很容易导致整合部位基因的插入失效，影响到克隆的纯度。高等株中存在非整合细胞，这种混合细胞内的细胞稳定结合，不会失去生长的优势。
细胞株的冻存步骤：
取培养2～3天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106～2×107/ml。在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜（或甘油），混匀后密封。置4℃ 1小时，－20℃ 2小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。
细胞株的复苏流程：
复苏时，从液氮中取出冻存管，立即置37℃水浴中融化细胞。将细胞直接加入10ml含15％小牛血清的RPMI-1640培养液中，置37℃ 5％CO2饱和水套式二氧化碳培养箱中培养。悬浮细胞待细胞全部沉降后小心吸去上清液，更换新鲜的上述培养液，继续培养；帖壁细胞则培养2～3实验。