中国农科院油料作物研究所：化学标记代谢组学中体积校正自由能预测保留时间辅助结构鉴定新方法

近日，中国农科院油料作物研究所油料品质化学与加工利用创新团队在分析化学领域国际著名学术期刊Analytical Chemistry (中科院一区TOP期刊，IF:8.008)上发表了题为“Volume-Corrected Free Energy as a New Criterion for Structural Elucidation in Chemical-Tagging-based Metabolomics”的研究性论文。该研究初步研究建立了化学标记代谢组学中体积校正自由能（VFE）预测保留时间维度用于提高未知化合物结构鉴定效率的一种新方法。

保留时间（r.t.）是基于液相色谱-质谱（LC-MS）的代谢组学技术中未知化合物结构解析的主要维度之一。预测未知化合物的保留时间可以在一定程度上减少通过已有实验结果信息（r.t.，质荷比m/z，MS/MS信息）进行结构鉴定时的假阳性结果。现阶段预测保留时间主要有三个方向，包括（1）基于深度学习/机器学习的保留时间预测；（2）归一化保留时间、保留指数和保留顺序等转化保留时间预测；（3）定量结构-保留关系（QSRR）模型构建。其中，QSRR模型是最流行的预测保留时间手段，其通过一个或多个代谢物分子描述符或固液界面分子描述符与已知分析物的保留时间建立数学关系模型，用于预测未知化合物的保留时间。然而，QSRR模型开发依赖于多个不同软件计算描述，涉及软件切换。不同化合物的QSRR模型所涉及描述符差异较大，有时一个模型仅适用于一类化合物。准备计算一些重要的描述符往往非常耗时，需要高性能计算机。化学标记作为代谢组学中常用技术，不仅可提高分析物覆盖率和检测灵敏度，也会改变代谢物保留时间，从而导致其在LC-MS分析中不同的保留行为。然而，很少有研究预测化学标记代谢物的保留时间。构建一种耗时少、预测性能好、通用性强的基于物理化学性质的保留时间预测方法或描述符对于基于化学标记的LC-MS分析中未知物保留特征的识别和结构解析具有重要意义。

Figure 1. Schematic of the new descriptor volume-corrected free energy (VFE) for structural elucidation in LC-MS analysis.

VFE描述符辅助结构解析的工作原理主要是基于反相色谱中代谢物理论计算VFE值与其保留时间直接相关。通过预测VFE值作为保留时间理论指标用于识别感兴趣未知代谢物的主要步骤包括（1）使用有限的化学标准品来确定未知代谢物在给定反相色谱柱上的保留行为；（2）从自建或公共数据库（Metlin、MassBank、HMDB、CLMD等）中获得测得m/z的可能化学式列表，然后使用化学式列表生成假定化学结构，最后利用付费或免费软件在计算机上计算VFE值；（3）通过简单的线性回归计算未知代谢物的VFE值范围，然后对上述化学式列表进行结构剔除过滤，获得候选化合物结构信息；（4）合成或购买候选化合物进行标准品比对，完成结构鉴定。在基于化学标记的代谢组学数据分析中，VFE计算大大缩短了结构解析时间（Figure 1）。

Figure 2. Identification of C15-OH from aged camellia seed oil by calculating the VFE values of putative compounds with m/z 290 Da, including six position isomers of Py-C15-OH and five isomers with the same protonation ion at m/z 290 Da.

作者给出了山茶油中正十五醇（C15-OH）的结构鉴定用于说明基于VFE计算的结构解析步骤。在老化山茶油（用吡啶试剂标记羟基官能团）中检测到一种r.t. 13.7 min@m/z 290 Da的未知化合物。从公开数据库中，检索出5个分子量为289 g mol-1 （质子化离子为m/z 290 Da）的化合物，包括(R)-1-phenyltetradecan-1-amine（C15-1）、N-tetradecyl-benzenamine （C15-2）、dihydroabiethylamine（C15-3）、N-Arachidonylamine（C15-4）、1-(1-cyclohexyl-2-nonyn-1-yl)-piperidine（C15-5）和6个吡啶羟基衍生物的位置异构体，包括 1-(pentadecan-2-yl)pyridine-1-ium （1C15）、 1-(pentadecan-3-yl)pyridine-1-ium（2C15）、1-(pentadecan-4-yl)pyridine-1-ium （3C15）、1-(pentadecan-5-yl)pyridine-1-ium （4C15）、1-(pentadecan-6-yl)pyridine-1-ium （5C15）、1-(pentadecan-7-yl)pyridine-1-ium （6C15）（Figure 2）。然后计算这些化合物的VFE值。在老化山茶油中添加C13-OH、C14-OH、C16-OH和C17-OH等的吡啶衍生物，得到它们的保留时间，计算得到VFE-r.t.线性回归方程（y=0.118x-2.9，r=0.9817）。前述未知化合物（r.t. 13.7 min@m/z 290 Da）的相对VFE值为-0.7718 kcal mol-1。根据VFE区域图像，C15-1至C15-5的相对VFE值范围为-0.0008 ~ 6.4851 kcal mol-1, 1C15至6C15的相对VFE值范围为-1.2106 ~ -1.7203 kcal mol-1(带阴影的方形区域)，而其中Py-C15-OH的相对VFE值为-0.7126 kcal mol-1，与未知化合物预测的相对VFE值接近，推测该未知物可能为C15-OH的吡啶衍生产物。最后，将该未知化合物用稳定同位素试剂[2H5]吡啶进行标记，并与C15-OH标准品的吡啶标记试剂和[2H5]吡啶试剂的标记产物进行保留时间偏差、稳定同位素质量偏差（Δm 5.03 Da）和二级质谱碎片离子质量偏差和稳定同位素碎片离子质量偏差等比对，确定该未知物为C15-OH。若采用传统比对方法，需要购买较多标准品进行验证，而采用VFE计算和区域图像分析可极大减少用于结构验证的化学标准品的合成或购置和一些不必要的MS/MS指纹图谱分析。

上述研究得到了国家自然科学基金青年基金项目（No.22104155）和武汉市科技局知识创新专项曙光计划项目（2060299-089-077）的资助。中国农科院油料作物研究所肖华明博士和中南民族大学硕士研究生彭小会为本文的共同第一作者，肖华明博士和魏芳研究员为本文共同通讯作者，中国农科院油料作物研究所为第一单位。论文其他合作者包括中南民族大学王献教授、常州大学赵帅副教授、卡拉奇大学Dilshad Hussain助理教授和岛津企业管理(中国)有限公司武汉分公司骆丹、陈建立工程师等。

文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c00722

文章引用：doi.org/10.1021/acs.analchem.3c00722

文章信息：Hua-Ming Xiao, Xiao-Hui Peng, Di Rao, Shuai Zhao, Dilshad Hussain, Jian-Li Chen, Dan Luo, Dan Wang, Xin Lv, Xian Wang, Fang Wei, Hong Chen, Volume-Corrected Free Energy as a New Criterion for Structural Elucidation in Chemical Tagging-based Metabolomics, Analytical Chemistry, doi:10.1021/acs.analchem.3c00722.

原文链接：

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原创：油料脂质分析实验室

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