核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)活性的测定

我们可以提供的试剂：

<原理>

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用碳代谢中的重要的调节酶，是植物中zui丰富的蛋白质，主要存在于叶绿体的可溶部分，总量约占叶绿体可溶蛋白50％～60％。本实验用分光光度法测定酶的羧化能力。

在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)与1分子的CO₂结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA)，PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶(PGK)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的作用，产生甘油醛-3-磷酸，并使NADH氧化，反应如下：

这里1分子CO₂被固定，就有2分子 NADH 被氧化。因此，由NADH氧化的量就可计算Rubisco的活性，由340nm吸光度的变化可计算NADH氧化的量。

为了使NADH的氧化与CO₂的固定同步，从而需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系统。

（一）实验材料

菠菜叶片、小麦及水稻叶片。

（二）试剂

1、5mmol/L NADH

2、25mmol/L RuBP

3、0.2mol/L NaHCO₃

4、Rubisco提取介质：40mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)缓冲液，内含10 mmol/L MgCl₂、0.25mmol/L EDTA、5mmol/L还原型谷胱甘肽。

5、反应介质：100mmol/L Tris-HCl缓冲液，内含12mmol/L MgCl₂和0.4 mmol/LEDTA.Na₂，pH7.8。

6、160u/mL磷酸肌酸激酶溶液。

7、160u/mL甘油醛-3-磷酸脱氢酶溶液。

8、50mmol/L ATP

9、50mmol/L磷酸肌酸。

10、160u/mL磷酸甘油酸激酶溶液。

11、菠菜的Rubisco提取液。

（三）仪器设备

紫外分光光度计，冷冻离心机，匀浆器，移液管，秒表。

<实验步骤>

1. 酶粗提液的制备

取新鲜菠菜叶片10g，洗净擦干，放匀浆器中，加入10mL预冷的提取介质，高速匀浆30s，停30s，交替进行3次；匀浆经4层纱布过滤，滤液于20000 rpm 4 ℃下离心15min ，弃沉淀；上清液即酶粗提液，置0℃保存备用。

2. Rubisco活力测定

按表20-1配制酶反应体系。

将配制好的反应体系摇匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上340nm处反应体系的吸光度作为零点值。将0.1mL RuBP加于比色杯内，并马上计时，每隔30s测一次吸光度，共测3min 。以零点到*分钟内吸光度下降的值计算酶活力。

由于酶提取液中可能存在PGA，会使酶活力测定产生误差，因此除上述测定外，还需做一个不加RuBP的对照。对照的反应体系与上述酶反应体系*相同，不同之处只是把酶提取液放在zui后加，加后马上测定此反应体系在340nm处的吸光度，并记录前一分钟内吸光度的变化量，计算酶活力时应减去这一变化量。

<结果计算>

式中：ΔA—反应zui初1min内340nm处吸光度变化的值（减去对照液zui初1分钟的变化量）。

N——稀释倍数。

6.22——每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数。

2——表示每固定1mol CO₂有2mol NADH被氧化。

Δt——测定时间1min。

d——比色光程，cm。