cyp3a65在斑马鱼中的时空表达及其对BDE47所致发育异常的影响

多溴联苯醚(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是一种运用广泛的溴化阻燃剂,也是受到广泛关注的持久性有机污染物。2,2’,4,4’-四溴联苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether,BDE47)是从人类血液和母乳样本中检测到的含量丰富的PBDEs同系物,具有内分泌干扰效应,可引发生殖、发育、神经、免疫以及肿瘤等毒效应。研究表明,新生儿脐带血中BDE47的浓度与其出生体重呈负相关,提示发育早期暴露于BDE47可能对胚胎发育造成损害,但BDE47所致发育毒性的机制尚不明确。生物转化是外源化学物对机体产生毒性作用的重要过程,主要由细胞色素P450酶(Cytochrome P450,CYP450)介导。课题组前期研究证实,BDE47能被CYP3A代谢生成毒性更强的OH-BDE47,并通过引起氧化应激和细胞凋亡,进而产生毒性作用,但CYP3A的生物转化在BDE47所致的发育毒性中的作用及其机制有待阐明。本研究运用BDE47染毒斑马鱼模型,敲降胚胎的cyp3a65,并运用经典抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)和植物提取抗氧化剂异甘草素(ISL)进行干预,旨在探究cyp3a65(与人CYP3A4同源)在BDE47所致斑马鱼胚胎早期发育毒性中的作用及其机制。部分cyp3a65在斑马鱼胚胎的时空表达谱及BDE47的诱导作用目的:评估cyp3a65在斑马鱼胚胎的表达部位、表达量和表达时间以及BDE47对cyp3a65表达的影响,为评价BDE47对斑马鱼的发育毒效应提供依据。方法:运用原位杂交确定cyp3a65在0-168 hpf野生型斑马鱼胚胎的表达部位。通过检测各时间点cyp3a65的转录水平,评估cyp3a65在0-168 hpf表达量的变化。建立BDE47(1μM)经水体染毒模型,运用原位杂交技术和Real-timePCR检测cyp3a65在各时间点和器官表达量的变化。结果:斑马鱼胚胎整体原位杂交结果显示,cyp3a65主要表达于斑马鱼的肝脏和肠道。cyp3a65从72 hpf开始微量表达,其表达量自96 hpf起明显增加。Real-time PCR 结果也显示,cyp3a6 的表达在 96-144 hpf 呈现显著上升趋势,但在144 hpf之后进入平台期。1μM的BDE47能够诱导cyp3a65表达。原位杂交实验显示,该诱导作用在72-120 hpf十分显著,但在144-168 hpf,BDE47对cyp3a65表达量的影响不明显。该效应同样被Real-time PCR实验证实,其原因可能是斑马鱼胚胎体内cyp3a65在144hpf的表达量已经达到了峰值。第二部分cyp3a65对BDE47所致斑马鱼胚胎发育异常的影响目的:评价BDE47对斑马鱼胚胎发育的影响以及cyp3a65在其中的作用。方法:运用吗啉反义寡核苷酸(morpholino antisense oligos,简称morpholino)技术对斑马鱼胚胎的cyp3a65进行敲降。基于野生型(WT)和cyp3a65敲降胚胎(MO)建立BDE47(0、0.5、1.0μM)经水体染毒模型,观察0-168hpf斑马鱼胚胎的主要毒性终点指标,包括自发活动、孵化率、畸形率、死亡率。此外,采用行为学分析系统检测120hpf各组胚胎的平均运动速度、平均活动性和总移动距离,以此评估胚胎的神经发育状态。通过对比BDE47处理下WT和MO组胚胎发育的表型差异,探究cyp3a65在BDE47所致斑马鱼胚胎发育异常中的作用。结果:与溶剂对照相比,BDE47没有改变斑马鱼胚胎包膜内自发活动的频率,但使斑马鱼胚胎在48-62hpf发生孵化延迟。此外,BDE47处理组胚胎从72hpf开始出现背向弯曲,畸形数量随染毒剂量增加而增加。在168 hpf,0.5和1μM BDE47处理的WT组(BDE47/WT)胚胎畸形率分别约为27.8%和68.0%,而溶剂对照组没有出现任何畸形胚胎。另外,BDE47组斑马鱼胚胎的死亡率也呈现出剂量和时间依赖趋势,0.5和1μM处理组胚胎死亡率在168 hpf分别为6.4%和16.8%。然而,敲降cyp3a65后,暴露于5μMBDE47的MO组(BDE47/MO)胚胎畸形率始终低于WT组(120 hpf,18%vs 100%)。120 hpf胚胎的行为学分析结果显示,对照组斑马鱼幼苗的平均运动速度在光照与黑暗中分别约为0.25 mm/s和2mm/s,BDE47/WT组的始终保持于0.8mm/s左右。然而,BDE47/MO组斑马鱼幼苗的平均运动速度恢复为在光照与黑暗中分别为0.4 mm/s和1.6 mm/s。此外,本实验中胚胎运动的活动性和移动距离也呈现出类似速度的趋势。对照组活动性和移动距离均在光照中低,黑暗中高,BDE47/WT组的活动性和移动距离始终保持于较低水平,BDE47/MO组的则恢复至接近对照组的水平。第三部分BDE47所致斑马鱼胚胎发育异常的氧化损伤机制目的:分析BDE47所致斑马鱼胚胎的氧化应激和细胞凋亡以及抗氧化剂干预对BDE47所致发育毒性的影响,探讨氧化应激在BDE47所致斑马鱼胚胎发育异常中的作用。方法:运用BDE47和抗氧化剂(NAC或ISL)共同处理斑马鱼胚胎,分别检测BDE47单独或与抗氧化剂联合暴露条件下,斑马鱼胚胎体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,抗氧化相关基因(Cu/zn-sod、Mn-sod、Car)和细胞凋亡相关基因(p53、Bax、Bcl-2、caspase3、caspase9等)转录水平的变化,并且运用吖啶橙染色检测斑马鱼胚胎整体的凋亡细胞。采用行为学分析系统检测各组胚胎在120 hpf的平均运动速度、平均活动性和总移动距离,评价斑马鱼胚胎神经发育状况。结果:1和10μMBDE47导致120hpf斑马鱼幼苗体内产生过量ROS,并呈现出剂量依赖性。BDE47能显著下调抗氧化相关基因Cu/zn-sod和Cat的转录、上调Mn-sod的转录。同时,BDE47显著降低抗氧化酶SOD和CAT的活性。此外,BDE47通过上调细胞凋亡相关基因p53、Caspase9、Puma,下调Bcl-2/Bax引起斑马鱼胚胎体内细胞凋亡。然而,抗氧化剂(NAC或ISL)显著减少BDE47所致畸形数量。在120hpf,BDE47处理组畸形率高达90%,NAC/BDE47和ISL/BDE47联合处理组的畸形率分别为30%和28%。NAC/BDE47和ISL/BDE47两组抗氧化酶SOD和CAT的活性均明显高于BDE47处理组。此外,NAC和ISL通过下调细胞凋亡相关基因p53、Bax、Caspase3和Caspase9的转录显著减少暴露于BDE47的幼苗体内的凋亡细胞。行为学分析结果显示,对照组斑马鱼幼苗的平均运动速度在光照与黑暗中分别约为0.45mm/s和1.5 mm/s,BDE47/WT组的始终保持于0.8 mm/s左右。然而,NAC/BDE47和ISL/BDE47组斑马鱼幼苗的平均运动速度恢复为在光照下0.7、0.5 mm/s,黑暗中分别为1.0、1.2mm/s。此外,幼苗运动的活动性和移动距离也呈现出类似速度的趋势。对照组活动性和移动距离均在光照中低,黑暗中高,BDE47处理组的活动性和移动距离始终保持于较低水平,NAC/BDE47和ISL/BDE47组的则恢复至接近对照组的水平。结论本研究在评价斑马鱼cyp3a65表达的基础上,利用敲降cyp3a65以及抗氧化剂,分别从生物转化和氧化应激角度探讨了 BDE47对斑马鱼胚胎早期发育的影响和机制,获得了如下结论:1.cyp3a65主要表达于斑马鱼的肝脏和肠道,从72 hpf起表达,表达量随时间推移而增加,在144 hpf达到峰值。BDE47能够显著诱导cyp3a65表达。2.BDE47导致斑马鱼胚胎暂时性孵化迟滞、畸形和死亡增加。BDE47所致斑马鱼胚胎畸形主要为背向弯曲,并可导致胚胎神经发育异常。敲降cyp3a65能明显降低BDE47对胚胎的毒性作用,提示cyp3a65的表达能增强BDE47所致的斑马鱼早期胚胎孵育毒性。3.BDE47通过诱导胚胎内细胞产生过量ROS,激活p53/caspase信号通路,导致靶器官细胞凋亡,进而产生发育毒性。有效的抗氧化剂NAC和ISL能够明显减轻BDE47所致形态畸形和行为异常,提示cyp3a65介导的BDE47的胚胎发育异常以氧化损伤为主。