日常科研三件套

文献、实验和文章

白天做实验，晚上看文献

相信各位老师在做实验的时候会遇到各种各样的问题

今天我们就来讲讲免疫荧光实验中

遇到的各种各样的问题，

包括它的概念和原理等等，，，

免疫荧光（IF）是什么

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

免疫荧光（IF）的原理

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

直接法

间接法

如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。

应用范围

其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。

基本实验操作步骤

（1） 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

（2） 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min.

（3） 通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.

（4） 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.

（5） 一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min.

（6） 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

（7） 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

注意事项

1、染完之后没有封片前直接照一 些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。

2、荧光的片子定要避光保存， 保存的好的话,过一段时间仍然能照出很好的片子。

3、二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。

4、整个操作在4°C下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高1 0倍的NaN3，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

5、洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

6、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白F受体,降低和防止非特异性染色。

7、细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可,之后片子可保留更长时间。