对于养细胞的人来说

可谓是谈“污”色变

每次养细胞总让人精神错乱

打开培养皿的那一刻

连呼吸都是如此多余

只要有任何的异样

无论是支原体还是杂菌

污染/污染/污染

犹如细胞实验的魔宙

让一切都无限重复

那么如何将失败率降到更低，让我们摆脱玄学的定律呢？

今天专门为大家盘点了细胞培养超实用干货

细菌污染最为常见，一旦操作稍有不当，就会引起细胞污染，细菌污染后显微镜下观察呈现有黑色细条沙状，当然，根据感染的细菌不同，所呈现的状态也不尽相同，有球形、杆状等，其次，培养液发黄，变浑浊，可明显看见培养皿中有细沙状的沉淀物，时不时还有异样气味发出，如下图所示：

处理方法：

　　在培养基中加入抗生素处理，可以用四环素，庆大霉素，或者链霉素，前两者的工作浓度是50 μg/mL;链霉素的工作浓度是100 μg/mL。但是，细胞本身也有影响，状态大不如从前，所以，防范于未然，正确操作、严格执行无菌操作规范，定期清理消毒培养设施才是关键!
二、真菌污染

　　真菌污染培养液清亮透明，不会像细菌感染大爆发，所以很难早期发现，镜下有时候象丝状，有时候象珊瑚状，慢慢地会长出很细的黑色丝状物，这个时候，已经晚了，细胞很难救活了。

处理方法：赶紧扔掉，不要再想挽救，即使再珍贵。然后*消毒灭菌培养间，CO2孵箱，器皿和培养液。

三、霉菌污染

　　同真菌感染一致，因为培养液是清亮的，所以霉菌污染早期难以发现，等发现时往往已经为时过晚了。培养液中慢慢地出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，如同风中柳絮，一般不仔细看发觉不出来。细胞仍可生长，但时间一长，细胞的状态就变差，不再增长。见下图。

　　处理方法：建议果断舍弃该污染细胞，将环境*消毒，因为霉菌的顽固可能会导致下几批细胞都会污染，所以，采用酒精*底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新洁尔灭擦洗一遍，把水盘里加上饱和量的硫酸铜。千万不可大意

四、支原体感染

　　培养液变浑浊，支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是细胞状态变差、生长变慢，在显微镜下观察可能会有小黑点，但培养基一般不发生浑浊。细胞传代以后就出现细胞间黑点，细胞空泡化，很多类似凋亡、坏死的细胞，最终细胞漂浮，*死亡。

处理方法：

　　如果不是很珍贵的细胞的话，建议直接扔了吧。

五、黑胶虫污染

开始污染时对细胞无影响，当数量达到一定程度时就会对细胞产生影响。400倍显微镜下可见点状或片状游动小体，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。

　　处理方法：可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率，尽早处理细胞，越快越好。

根据细胞生长特性的不同，传代可分为悬浮细胞传代和贴壁细胞传代两种类型，对于悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用离心法后，加入新培养基后再吹打分散进行传代；贴壁生长的细胞则用消化法进行传代，下面我们介绍传代培养的一些注意事项；

一、贴壁细胞传代如何使用胰酶？

一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。

消化液浓度过高时，易造成培养基中细胞碎片增多，黑渣子增多，常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化，对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化，细胞密度过高超过80%时，采用分步消化法。胰酶储存在–20°C，解冻在4°C进行，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。

二、如何控制胰酶消化时间？

胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤：消化过度细胞碎片增多，黑渣子增多，细胞会成片脱落，严重影响细胞活性，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。

不同细胞对消化液的敏感性不同，胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度，是否含EDTA，胰酶的储存时间，胰酶的储存温度，是否反复冻融，消化加入的胰酶体积，消化温度及细胞的密度有关。消化对于新购买的细胞，建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间，可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆，记录最佳消化时间，下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

三、细胞抱团怎么处理？

一些悬浮细胞抱团生长是正常现象，大部分悬浮细胞在细胞密度很高的情况下，很可能会出现部分细胞抱团生长的现象，聚团细胞很容易死亡并演化成絮状物，殃及周围的悬浮细胞，因此在培养悬浮细胞时需控制好细胞密度。如果出现了细胞团，可以通过细胞筛去掉部分较大的细胞团，也可以尝试一下方法：将细胞悬液收集到15 ml离心管中，静置20 min左右，小心取上层细胞上清培养（该方法只能去除部分较大的细胞团）。

四、细胞内有空泡，是否是正常现象？

部分细胞本身存在一定的空泡（如HepG2，Ishikawa及一些耐药株等），这个是正常现象。如果只有少数细胞有内出现极少空泡，则很可能是细胞状态不佳，可以通过调整血清浓度，控制消化，控制传代比例及时间等方法来调整细胞状态；如果大部分细胞出现空泡，且单个细胞内空泡数目偏多，则可能细胞代次较高，细胞老化所致，需更换代次较早的细胞。

五、细胞生长逐渐变慢是什么原因？

细胞增殖变慢有以下原因：1. 消化过度 2. 传代过密 3.细胞营养不良 4.细胞频繁传代 5.细胞状态不佳或老化 6.细胞存在污染。

六、细胞何时进行传代较好？

一般情况下细胞生长至*汇合后就应该传代，所有细胞生长都有一个要求不宜生长过密（也就是常说的长老了），但有接触抑制的细胞，在汇合前就必须进行传代，这类细胞一般在密度70-80%就进行传代，否则会引起细胞分化。

一、复苏

1）取出冻存管，立即放入37度水浴箱中快速解冻（1分钟左右），水面不可没过盖子，以避免污染。

2）将冻存管移至无菌操作内。打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中，1000rpm, 5min，弃上清。

3）加入适量*培养基，置于37度恒温箱中培养即可。

4）次日更换一次培养液,以去除任何残留的冷冻保护剂，继续培养。

二、冻存

1）用无菌吸管吸弃瓶内旧的培养基；

2）加入少量 PBS 冲洗二遍， 用胰蛋白酶把单层细胞消化下来，依据传代的方法把细胞 悬液收集于离心管中，离心 1000 rpm，5-8 min； 

3）小心弃上清液，加入配置好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后将含有 细胞的冻存液转移到无菌的冻存管中，每个冻存管加液 1-1.5 ml，细胞最终密度为 （5—10）×106 /ml； 

4）冻存管封口，做好标记，按照以下程序冻存：

第一种方法：标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min；到-150℃时，则可迅速浸入液氮中。

第二种方法：冻存管放入4℃，约30 min,﹣20℃ 30min- 60 min，见细胞悬液结冻后，放入﹣80 ℃冰箱， 过夜后转入于液氮罐中。 

第三种方法：将冻存管放于程序降温盒中，并置于-80℃冰箱4h以上，转入液氮罐中长期保存。