1 、将标准品和样品对应的微孔编号，每个标准品和样品做双孔平行，并记录标准品和样品的位置。

2 、在标准品孔中加入 50µl 各标准品溶液，酶标仪在各样品孔中加入 50µl 样品溶液。

3 、在所有孔中加入 50µl 的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀， 25 ℃环境中避光反应 30 分钟。

4 、小心揭开盖板膜，甩干孔中液体，用稀释好的洗涤液（ 250μl/ 孔）充分洗涤微孔板 3 次，在吸水纸上拍干（拍干后未清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

5 、酶标仪在所有孔中加入 100µl 的酶标二抗，酶标仪用盖板膜封板，轻轻振荡混匀， 25 ℃环境中避光反应 30 分钟。取出酶标板，按步骤 4 洗板 5 次。

6 、洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入 50µl 底物液 A ，再加 50µl 底物液 B ，轻微晃动反应板使之*混匀， 25 ℃环境避光显色 15 分钟 ( 在颜色浅的情况下可适当延长反应时间，但总显色时间不要超过 30 分钟 ) 。

7 、每孔中加入 50µl 终止液，轻轻晃动使之*混匀，在 450nm （建议使用双波长 450/630nm ）下检测吸光度，结果在 5 分钟内读取。