那么下面上海嘉鹏科技有限公司为大家简单介绍一下关于蛋白质纯化方法经典攻略（一）：

蛋白质纯化工艺的建立

建立蛋白质纯化工艺时，*重要的是需要考虑纯化得到的蛋白质应能满足其后续应用要求。蛋白质的数量及纯度都必须满足实验分析要求。而且，因为后续研究需要的是保持良好折叠结构的活性蛋白质，因此蛋白质行为的相关信息也需要考虑。在纯化及后续的保存过程中，很多处理方法都会对蛋白质的性质产生影响，如蛋白质的去折叠、聚集、降解和失活等。制定详细计划，在*短时间内完成蛋白质纯化，并在*稳定的条件下进行保存才算是成功地完成了其整个纯化过程。
缓冲液体系每一步纯化过程中，蛋白质的溶液环境对其稳定性和活性的保持都非常关键。蛋白质应该保存在一个良好的缓冲液环境中，要避免突然的pH值变化，以其防止对蛋白质折叠状态、溶解性和活性造成不可逆的影响。

缓冲液是一种含有共轭酸/碱对的水溶液。缓冲液的pH值范围根据其pKa值决定。该pKa值定义为50%的分子为酸式结构，50%为碱式结构时的pH值 （图1）。

Tris 25°C的pKa值是8.06，表示当pH=8.06，50%的Tris是质子化（酸式结构），50%是去质子化（碱式结构）。
关于缓冲液的一个常规原则是，其pH值应保证在pKa值左右1个pH值单位范围内，从而保证其具有良好的缓冲能力。如此可以保证同时有足够的以酸式结构和碱式结构存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 时可以将它们中和。这样，缓冲液就可以防止pH变化导致的蛋白质稳定性改变。
一种好的缓冲液必须具有以下特征  :1、水溶性2、化学稳定性3、在所需pH范围内良好的缓冲能力4、与分析和实验应用条件具有良好的兼容性5、与其他溶质具有良好的兼容性
很多物质都可以用于生物缓冲液。*常使用的缓冲液成分通常具有接近中性的pKa值，可在生理pH值范围左右使用。表1列出了4种*常用的生物缓冲液、各自的pH值应用范围及各自可能对蛋白质纯化过程产生影响的优缺点。为保证足够的缓冲能力，这些缓冲液的浓度通常为25mM。

其他因素蛋白质纯化工艺中的其他因素也会对蛋白质的稳定性产生影响。对蛋白质的处理步骤越少越好，在*短时间内采用*少步骤的纯化工艺才能保证得到*高产率的活性蛋白质。而且，在整个纯化过程中，蛋白质*好都保持在低温状态。一般纯化过程都在4°C进行,因为这个温度既可以降低酶解速度（在含有蛋白酶的情况下），又可以保证蛋白质的结构完整性。
表达体系对蛋白纯化的影响开始纯化蛋白前应先制备初始样品。真正进行蛋白纯化的操作之前，首要考虑是目的蛋白的来源。样品来源可为原始样品，例如肝脏，肌肉或脑组织。虽然后基因组学领域的研究者很少使用原始组织纯化蛋白，但当研究者想要关联某一蛋白序列的催化活性时，会有这样的需求。
当前，更为常见的是从重组来源的样品纯化蛋白质。一些重要决定需要提前考虑以便优化后续的纯化。研究者需要考虑蛋白质的*终用途（例如酶测定，结构研究，抗体生成），因为这将决定*终蛋白质制备所需的量和纯度。尽管蛋白质表达的详细讨论超出本文范围，但是在这一点上仍有几个值得考虑的基本点，因为它们直接影响后续的蛋白纯化。
哪个系统的表达水平*高？一般规则是，表达水平越高，越容易获得大量高度纯化蛋白。如果选择大肠杆菌表达系统，*终目的可溶性表达或不可溶表达是包涵体形式吗？由于包涵体中有高丰度的重组蛋白，包涵体的分离本身构成了纯化的重要步骤; 这必须与溶解难易和随后包涵体中再折叠靶蛋白的难易以及可溶性蛋白的*终产量相平衡。已经有许多工作优化了从包涵体中产生功能蛋白的产量。
另一个考虑是是否靶向胞内或胞外（分泌的）表达。胞内表达需要将蛋白质从大量宿主细胞蛋白中纯化而来。相比之下，特别是当宿主细胞在无血清条件下生长时，目标蛋白的有效分泌要求蛋白必须从少量分泌的宿主蛋白中纯化而来。

        以上就是上海嘉鹏科技有限公司为大家整理总结蛋白质纯化方法经典攻略（一）。

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