mRNA文库构建试剂盒
时间：2019-05-22 阅读：3027
mRNA：即messenger RNA 信使RNA是由DNA经由转录而来，带着相应的遗传讯息，为下一步转译成蛋白质提供所需的讯息。在细胞中，mRNA从合成到被降解，经过了数个步骤。在转录的过程中，第二型RNA聚合酶从DNA中复制出一段遗传讯息到mRNA前体pre-mRNA上。在原核生物中，除了5'加帽之外mRNA并未被进一步处理而经常是边转录边转译。在真核生物中，转录跟转译发生在细胞的不同位置，转录发生在储存DNA的细胞核中，而转译是发生在细胞质中。
一、文库类型
根据研究对象不同选择相应的建库方法
在测mRNA过程中，首先要去除rRNA。以人为例，在抽提的总RNA中，95%的RNA是rRNA，2%的RNA是mRNA，剩下的则是lncRNA、microRNA、siRNA等。rRNA整个人类当中是非常保守的，在各个组织器官中也是非常稳定的，因此这些测序结果对我们的研究是没有用处的。mRNA则是RNA中比较重要的部分。
二、建库流程
Illumina、Kapa公司的Truseq RNA建库方法是应用广泛的一种，真核普通转录组为例：
首先以mRNA的Poly(A)(高等生物*的)这个特点，让带有Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，使mRNA和磁珠相结合在一起。接着回收磁珠，将带有Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。
然后用镁离子溶液将洗脱下来的mRNA打成片段，被打断的mRNA片段用随机引物逆转录出链的cDNA，再合成出第二链，这样就有了双链cDNA。对双链cDNA末端修复，加A加接头。片段选择，PCR扩增、纯化（如果样本中存在污染物，则需要结合试剂盒进一步纯化）。
注：
这个建库方法对mRNA的完整性有较高要求，因此如果mRNA发生降解，那么磁珠只能吸附靠近3’端的mRNA断片，会在富集阶段被洗脱，导致后数据有一定的偏差（在RNA测序质控时就能发现mRNA的3’端以及5’端是否有偏移）。
一般在会测序前对总RNA进行一次质检，根据电泳质检结果中的18S和28S（rRNA）两个峰的高度以及峰的尖度来判断RNA的质量，峰越高越尖（RIN > 8.0）表示RNA的完整度越好。除了mRNA普通文库构建外，还有真核链特异性文库、lncRNA文库、SmallRNA文库等。针对一些FF(Formalin-Fixed)样本和FFPE(Paraffin-Embedded)石蜡包埋样本以及原核生物的总RNA中去除rRNA，不适合用上述mRNA建库方法。需要结合RiboZero、RiboMinus等来去除，其实是针对rRNA序列进行杂交捕获去除的原理来去除的。
Oligo(dT)30磁性微球是基于碱基互补配对原则以及mRNA含有poly(A)尾巴的特点设计而成，适用于从真核总RNA，或直接从细胞、部分病毒、动物和植物组织的粗提物中快速分离完整的高纯度mRNA。
磁性微球产品订购信息
产品名称 货号 储存温度 保质期
Oligo(dT) 30 磁性微球 MS04T 2-8℃ 2年
TruSeq standed mRNA Library Prep mRNA文库构建试剂盒
KAPA mRNA文库构建试剂盒适用于illumina测序平台，该试剂盒适用于去除了tRNA或富含poly(A)的10-400ng RNA为模板构建RNA文库所需的所有酶和缓冲液。
产品应用：
- 基因表达；
- 新的转录本和SNP鉴定；
- 拼接位点及基因融合识别。
产品优势
- 减少样品手动操作及总的时间
- 从100ng ~ 4ug 的灵活DNA样本量
- KAPA HiFi酶在文库扩增中有强有力的表现
- 试剂及反应体系便于自动化操作
Kapa试剂盒产品订购信息
品牌 货号 名称 规格
KAPA KK8420 KAPA Stranded mRNA-Seq Library Preparation Kit -illumina平台 24sample
KAPA KK8421 KAPA Stranded mRNA-Seq Library Preparation Kit -illumina平台 96sample
TruSeq链式mRNA文库制备试剂盒以精简、经济及可扩展的方式对mRNA-Seq进行文库制备，可测量链取向。准确测量基因和转录本丰度，并检测编码转录组中的已知特征和新特征。
产品英文名称：TruSeq® Stranded mRNA Library Prep
产品中文名称：TruSeq链式mRNA文库制备试剂盒
Illumina TruSeq链式mRNA文库制备试剂盒特点
TruSeq链式mRNA文库制备试剂盒为编码转录组分析提供了一个精简、高性价比且可扩展的解决方案。它与多种样本兼容。
精密准确
此试剂盒可让您测量mRNA链方向性以检测反义转录本，并为您增强转录本注释和提高比对效率。其提供高度均匀的覆盖能力，可更好地发现可变剪切、基因融合和等位基因特异性表达等特征。
性价比高
链信息可让您识别RNA转录本来自于2条DNA链中的哪一条。此信息提高了转录本注释的可信度，尤其针对非人类样本。识别链起源可增加比对片段百分比，从而降低每个样本的测序成本。
可扩展
该试剂盒能可靠检测标准和低质量样本，且其工作流程可与众多不同的研究设计兼容
Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prep产品订购信息
品牌 货号 名称 规格
Illumina 20020594 TruSeq® Stranded mRNA Library Prep 48 Samples
Illumina 20020595 TruSeq® Stranded mRNA Library Prep 96 Samples
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