个要给大家讲的，是它这个flowcell。Flowcell翻成中文，就叫“流动池”。

我们来看这个图片。图片当中，我们看到一个象载玻片大小的芯片。这个芯片里面，是做了8条通道。在这个通道的内表面，是做了专门的化学修饰。它的化学修饰，主要是用2种DNA引物，把它（2种DNA引物）种在玻璃表面。

这两种（DNA引物的）序列是和接下来要测序的DNA文库的接头序列相互补的。而且这2种引物是通过共价键，连到Flowcell上去。之所以要用共价键连到Flowcell上去，是因为接下来有大量的液体要流过这个Flowcell，只有有共价键连接的这些DNA，才不会被冲掉。这就是Flowcell。

文库制作

再接下来，讲一下文库、和文库的制作（过程）所谓的DNA文库，实际上是许多个DNA片段，在两头接上了特定的DNA接头，型成的DNA混合物。

文库有2个特点，第1个特点，是当中这一段插入的DNA，它的序列是各种各样的。第2个特点，它的两头的接头序列，是已知的，而且是人工特地加上去的。要做这个文库，首先是把基因组DNA，用超声波打断。然后打断之后，两头用酶把它补平，再用Klenow酶在3'端加上一个A碱基。然后，再用连接酶把这个接头给连上去。

连好了接头的DNA混合物，我们就称为一个“文库”。英文也称作“library”。

桥式PCR

做好了Library之后，就要做桥式PCR了。桥式PCR，实际上是把文库种到芯片上去，然后进行扩增，这样的一个过程。

这个过程，首先是把文库加入到芯片上，因为文库两头的DNA序列，和芯片上引物是互补的，所以，就会产生互补杂交。

杂交完了之后，我们在这里面加入dNP和聚合酶。聚合酶会从引物开始，延着模板合成出一条全新的DNA链来。

新的这条链，和原来的序列是*互补的。

接下来，我们再加入NaOH碱溶液。DNA双链在NaOH碱溶液存在下，就解链了。而且被液流一冲，原来的那个（模板）链，也就是没有和芯片共价连接的链，就被冲走了。而和芯片共价连接的链，就被保留下来。

然后，我们再在液流池里加入中性液体，主要是为了中和这个碱液，在加入中和液之后，整个环境变成中性了。这时侯，DNA链上的另外一端，就会和玻璃板上的第二种引物，发生互补杂交。

接下来，我们加入酶和dNTP，聚合酶就延着第二个引物，合成出一条新链来；然后，我们再加碱，把2条链解链解开；然后，我们再加中和液，这时侯，DNA链会和新的引物杂交。再加酶，再加dNTP，又从新引物合成出新的链来。

连续重复这一过程，DNA链的数量，就会以指数方式增长。

制备单链

在桥式PCR完成之后，接下来要做的工作，就是要把合成的双链，变成可以测序的单链。

办法是通过一个化学反应，把其中一个引物上的一个特定的基团给切断掉。

然后，再用碱溶液来洗这个芯片。这时侯，碱让DNA的双链解链，那根被切断了根的DNA链就被水冲掉了。留下那根共价键连在（芯片）上面的链。

接下来，再加入中性溶液，然后在这个中性溶液里面加入测序引物。

正式测序

好，接下来正式的测序工作就开始了。

那么，在测序的时侯，加入进去的，主要是2个东西：一个是带荧光标记的dNTP。而这个dNTP，它还有一个特点，它的3'末端是被一个叠氮基堵住的。

然后，再加一个聚合酶，聚合酶就会选择：哪一个dNTP是和原来位置上的那个碱基是互补的，根据互补性原理，把这个dNTP合成到新的这个DNA链上去。

因为这个dNTP的3'端是被一个叠氮基团堵住了，所以，它一个循环只能延长一个碱基。然后，它就停在那儿了。

合成完了之后，就用水把多余的dNTP和酶给冲掉。

冲掉之后，就放到显微镜下，去进行激光扫描。根据发出来的荧光来判断它是哪个碱基。

因为4种dNTP，它每一种dNTP上面标的荧光素都不一样，根据红、黄、蓝、绿，它出来的哪种颜色，那么，就可以倒过来推出来，这个新合成上去的碱基，是哪种碱基。

因为新合成的碱基，是和原来位置（的碱基）是互补的，所以，又推出模板上那个碱基是哪个。

这一个循环完成之后，就加入一些化学试剂，把叠氮基团和旁边标记的荧光基团切掉。切完了之后，3'端的羟基就暴露出来。

再接下来，加入新的dNTP和新的酶，然后，又延长一个碱基。新延长完一个碱基之后，把多余的酶和dNTP冲掉，再进行一轮显微的激光扫描，再读一下这个碱基是什么。

不断重复这个过程，可以重复上百次，到几百次，就可以把上百个碱基，甚至更多碱基的序列读出来。

读Index

那么，什么是Index哪？是因为Illumina的评委会个测序量很大，往往一个样本，用不了那么几亿条DNA。所以，科学家就想了一个办法。在文库的接头上做了一些标记，每一个样本，它有一个特定的接头，每个接头里面，它有一段特定的序列。

这段特定的序列，我们就称为Index。也有人把它叫做Barcode，反正，表达的是一个意思：这么一段特定的序列，标记了样本的来源。

那么，要读这个Index的序列，先用碱把上面这根测完“Read1”的序列，把上面这根DNA链给解链掉。

红荣微再（上海）生物工程技术有限公司是一家代理illumina产品的中国公司

更多illumina产品，现货供应，欢迎咨询

欢迎您的致电  400  021  2200                    150  2101  0459

提供产品：华雅再生医学旗舰公司-红荣微再（上海）生物工程技术有限公司为中国再生医学和生物工程技术领域的组织器官再生研究、组织器官功能重建研究、干细胞技术研究、组织工程生物支架材料研究、医疗器械产品等再生医学产业链的相关客户提供：iPS/ES胚胎干细胞的种子细胞、心肌细胞、人源肝脏细胞、MSC间充质干细胞、基底膜基质胶细胞支架、干细胞生长分化调控因子、干细胞药物研究的小分子抑制剂、调节剂、小分子化合物、功能胶原蛋白生物材料、3D细胞培养基质胶、器官模型3D打印技术材料、神经干细胞培养基、STEM121抗体、BD科研P100、P800蛋白质组学采血管、BD血浆准备管PPT管、BD PAXgene全血RNA样本收集管、BD公司CPT/PRP美容采血管、Streck Cell-Free RNA BCT游离RNA样本收集管、Streck Cell-Free DNA Urine Preserve游离DNA尿液保存管、Streck Cell-Free DNA BCT游离DNA采血管、循环肿瘤细胞CTC及无创产前基因检测采血管、illumina高品质NGS文库制备试剂盒、ThruPLEX ctDNA测序试剂盒、全基因组测序、全外显子测序、靶向测序、ChIP-Seq测序、CNV和染色体异倍性分析、Rubicon Genomics单细胞全基因组测序试剂盒、生物医学试剂耗材仪器等种类丰富的产品，以“Focus on Tissue and Organ Regeneration专注组织器官再生与功能重建”为己任，我们与客户携手为中国再生医学产业的发展而前行。