RNA-seq（RNA sequencing）是一种利用高通量测序技术来测定RNA样本的方法，它可以提供关于转录组的详细信息，包括mRNA、microRNA、lncRNA等不同类型的RNA分子的表达水平、剪接变异、融合转录本以及新的转录本等。以下是RNA-seq的基本步骤和技术原理：

1. 样本准备：

• 总RNA提取：首先从样本中提取出总RNA，这一步通常需要使用商业化的RNA提取试剂盒。

• rRNA去除：由于rRNA在总RNA中占比很大，因此通常需要去除rRNA以提高后续测序的效率。这可以通过多种方法完成，例如使用特异性引物的寡聚dT磁珠捕获poly(A)+ mRNA或使用rRNA特异性探针进行杂交捕获。

2. cDNA文库构建：

• 反转录：使用逆转录酶将mRNA转换成cDNA。

• 文库片段化：如果需要，可以通过超声波或酶处理将cDNA片段化。

• 接头连接：在cDNA片段的两端加上测序接头，以便于后续的测序过程。

• PCR扩增：通过PCR扩增文库，增加文库的拷贝数，同时也可以在此步骤中引入索引（index）以便进行多重测序。

3. 测序：

• 使用高通量测序平台（如Illumina、Thermo Fisher的Ion Torrent或PacBio等）对文库进行测序。目前最·常用的测序技术是基于Illumina平台的短读长测序，可以产生几十到几百碱基长度的序列片段。

4. 数据处理和分析：

• 原始数据质控：对原始的测序数据进行质量控制，去除低质量的reads。

• 序列比对：将测序得到的reads与参考基因组或转录组比对，确定它们在基因组中的位置。

• 表达量化：根据比对结果，计算每个基因或转录本的表达水平，常用的方法有FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads) 或TPM (Transcripts Per Million)。

• 差异表达分析：比较不同条件下的样本，找出差异表达的基因。

• 其他高级分析：还可以进行剪接变异检测、新转录本预测、非编码RNA分析等。

整个RNA-seq流程涵盖了从样本处理到数据分析的多个步骤，每一环节都需要细致的操作和严谨的数据处理。随着技术的发展，RNA-seq已经成为转录组研究中不·可·或缺的工具，广泛应用于生物学、医学、农业等多个领域。

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