外周血单个核细胞分离方法
时间：2016-01-29 阅读：2215
水性高，平均分子量为
400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
二方法:
1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank"s液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和
Hank"s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、
中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带如下图，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank"s液或RPMI1640，
1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度细胞数／1毫升细胞悬液＝ 4个大方格内细胞总数 ────────── × 10４×2稀释倍数 4
6. 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。 活细胞数 活细胞百分率＝────── ×100％ 总细胞数 用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。