ELISpot是一种用于定量分泌某种特定靶标分析物细胞的免疫测定方法。整个刺激过程中细胞分泌的细胞因子、抗体或其他靶蛋白在分泌后会立即被特异性抗体捕获，这种即时捕获使ELISpot成为一种在单细胞水平上极其灵敏的检测方法。

细胞在刺激存在或不存在的情况下，在包被有特异性捕获抗体的膜孔中进行培养，因此，细胞分泌的目标蛋白会被立即捕获。经过适当的时间孵育后，取出细胞，使用检测抗体检测分泌的靶标分析物。加入染色底物后，最终在膜表面上出现可见的斑点。每个点对应一个单独的分泌目标蛋白质的细胞。

图1.ELISpot检测示意图

想要做好ELISpot实验，从最开始包被抗体到最后检测的每个实验细节都需要注意。大家往往可能会忽略一个细胞处理的细节步骤，即细胞静置步骤。该步骤有可能会显著影响ELISpot实验的准确性。下面Mabtech带我们深入了解一下为什么细胞静置这一步至关重要，以及如何正确完成。

ELISpot分析非常灵敏，能够检测到分泌靶标分析物的单个细胞，但实际情况中有可能非实验性体内刺激或分离细胞过程中的搅动会使细胞自发分泌高水平的靶标分析物，如细胞因子或抗体，导致检测结果失真。ELISpot检测前的细胞静置步骤有助于确保细胞处于自然、未受刺激的状态，从而更准确地反映其正常的靶标分析物分泌水平。静置细胞的另一个重要作用是去除细胞碎片，确保更干净的背景。

如何进行细胞静置处理呢？

1.分离细胞:首先分离好实验所需的PBMCs、T细胞、B细胞或其他免疫细胞。

2.调整细胞密度:在分离和洗涤细胞后，测量细胞活力，并将细胞密度调整到适合静置的水平。通常，细胞密度约为每ml培养基1-2百万个细胞。Mabtech建议将细胞放在50ml或15ml的无菌锥形管中，并稍微拧松盖子，以便在培养时进行气体交换。

3.静置细胞:在37℃、含5% CO2的无菌培养箱中培养细胞。让细胞静置至少一个小时，或者过夜。最佳静置时间可能因细胞类型和检测的具体情况而异，需要进行一些优化。

4. 静置期结束后，轻轻地重悬细胞，让一些结块的细胞碎片落到试管底部。避免结块漂起，将细胞悬液转移到一个新的50 ml试管中进行洗涤步骤。

5.离心洗涤细胞，倒出上清液。重新悬浮在新鲜培养基中，并重复一次洗涤步骤。

6.  再次检测细胞活力，并将细胞数量调整到ELISpot检测所需的适当水平。

温馨提示：本文中的实验步骤仅供参考，实验时请按照产品说明书操作。

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