多年来，垂直扩散池，又称为Franz扩散池，一直被用于研究药物分子的皮肤传导。这种简单的体外方法对于测量药物经皮肤转运和/或渗透到皮肤中的速率和程度非常有用。如果应用了相关的皮肤模型，则它是评估经皮药物吸收的有用工具，特别是当目的是评估新药候选物或筛选用于皮肤应用的新药模拟物时。在过去的几十年里，垂直扩散池的使用也成为局部和透皮药物产品性能测试的重点。然而，当体外试验旨在评估局部或透皮产品在生产后、保质期内或放大和批准后变化后的质量(SUPAC，下载链接见本文末尾部分)时，基于皮肤的扩散模型不再适用。使用人皮肤或动物皮肤的试验方法当然需要了解各种药剂在目标物种皮肤上的过程、途径和驱动力，但由于皮肤特性的种内和种间可变性较大，不适用于产生对质量控制(QC)至关重要的可再现和稳健的试验条件。因此，出于QC目的，IVRT的目标是关注物理属性(溶解度、微观粘度、乳液状态、粒度等)可能影响药物从半固体制剂中释放行为，则皮肤必须用适当的膜代替。同时在IVRT实验中，必须明确定义与药物释放相关的所有检测参数，以获得一种有区分力且耐用性良好的QC检测方法。

本研究目的是参考Sandra Klein及锐拓实验室的研究成果，展示不同实验参数对垂直扩散池中获得体外药物释放曲线（IVRT曲线）的影响，也同时展示IVRT方法开发过程中，实验室方法开发人员需要考虑的部分内容，以减少IVRT方法开发中的存在的问题。

2.1膜材料和孔径的影响

采用组成和稠度不同的两种凝胶制剂Voltaren® Emulgel®和Diclofenac-ratiopharm Gel，探索了膜材料和孔径对体外扩散速率的影响。溶出介质为pH 7.4的磷酸盐缓冲液，搅拌速度为800 rpm。根据FDA 《In Vitro Release Test Studies for Topical Drug Products Submitted in ANDAs Guidance for Industry》，释放速率为累积释放量对时间平方根的回归曲线的斜率r。结果如图1所示。

溶出曲线表明，膜材料和孔径均可对双氯芬酸凝胶制剂的体外扩散速率产生影响。尽管所测试的大多数膜的结果没有很大差异，但当使用PET膜时，两种配方的扩散速率都要高得多。然而，这很可能是使用这种膜引起的偏差。由于很难将PET膜固定到位，且PET膜易起皱，因此未将其用于后续研究。总体而言，聚砜(Tuffryn)膜被视为最合适的膜，用于后续筛选实验。

2.2溶出介质pH的影响

双氯芬酸是一种弱酸，其钠盐的pKa值为4.0(25°C)。根据药物的酸碱性，预计受体介质的pH值会影响扩散速率。为了考察溶出介质pH的影响,使用pH为7.4、6.5和5.0的三种不同pH的溶出介质，考察了溶出介质pH对Voltaren® Emulgel® 和 Diclac® Schmerzgel的扩散速率、药物释放的影响。使用Tuffryn膜分离制剂和溶出介质，用磁棒和螺旋搅拌器以800 rpm搅拌溶出介质。结果见图2。

正如预期，在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，两种配方的药物释放速率最高。溶出介质越接近药物pKa值，药物释放速率减慢，这在Diclac® Schmerzgel的释放曲线中尤其明显。在pH 5.0缓冲液中，药物浓度达到了一个平稳值，这反映了双氯芬酸在该pH值下的溶解性差，也表明当实验旨在考察漏槽条件下的药物释放时，该缓冲液不合适。为了达到漏槽条件，受体介质必须具有高溶解或带走药物的能力，并且受体介质中的药物浓度不应超过释放基质中药物溶解度的10%(〈1724〉 SEMISOLID DRUG PRODUCTS—PERFORMANCE TESTS)。由于新候选药物的漏槽条件很难确定，因此在开始释放实验之前，应测定化合物在推荐溶出介质中的溶解度，以确保选择正确的溶出介质进行实验。对于双氯芬酸等酸性药物，当目的是观察不受pH影响下的解离(可通过Hendersson-Hasselbalch方程计算)和药物化合物溶解度阻碍的扩散时，溶出介质应为pKa 加至少2个pH单位。

2.3脱气的影响

我们进行了多次对接受介质使用前脱气和不脱气对照实验。每当介质未脱气且气泡出现在膜下时，这将导致溶出速率大大降低(取决于气泡的数量和大小)。然而，绘制药物释放量(μg)与的关系图仍可得出线性关系，这也是USP1724进行IVRT分析时要求使用Higuchi模型分析数据的原因。而使用脱气机可以用于介质的脱气并有效地改善气泡问题。

2.4搅拌速度和搅拌器类型的影响

使用Voltaren Emulgel作为试验配方，研究了不同搅拌速度和不同搅拌器类型(即带有和不带有附加螺旋搅拌器的磁性搅拌棒)的影响(见图6)。结果清楚地表明，搅拌速度和搅拌器类型对释放/扩散速率都有影响(图3)。

图3左所示的结果表明，在扩散池底部使用简单的磁性搅拌棒（下图）并不是最佳搅拌器模式，尤其是在低搅拌速度下，流通池中的流体力学不足以进行充分混合。图3中所示的曲线还表明，对于每种搅拌器类型，都存在临界搅拌速度。使用磁性搅拌棒进行充分混合需要非常高的搅拌速度(> 800 rpm)。使用磁性搅拌棒和螺旋搅拌器，在200 rpm的搅拌速度下，可以观察到低药物释放率和高的标准偏差。然而，随着搅拌速度提高，释放速率重现性显著改善，在等于或高于600 rpm的搅拌速度下，这些曲线可以重合。因此，600以上的搅拌速率是提高释放速率重现性的优选速率。

另外，锐拓实验室进一步对搅拌子的结构研究后发现，良好的搅拌子结构（下图）有助于充分混合扩散池中的药液。以KHP标准物质作为样品，KHP的吸光度在取样臂&接受池中的数值为表征，研究了不同转速条件下搅拌取样臂与接受池中样品的混合效果，研究中发现，在不施加搅拌的条件下静置30sec，取样臂中的药物无法通过自由扩散达到混合均匀的效果，取样臂中的药物浓度仅为接受池中药物浓度的1/60。但是在分别施加200rpm及600rpm的搅拌条件下，取样臂中的药品浓度与接受池主体中的药品浓度能够在30sec内迅速达到均匀，从而解决了取样臂中药物浓度与主体药物浓度不一致的问题，进一步有效地避免FDA 1724章节中描述的负通量的产生。

2.5最佳条件下市售半固体双氯芬酸制剂的药物释放

基于第一组实验中获得的结果，认为以下测试参数适用于从用于皮肤用的半固体双氯芬酸制剂中获得可靠且可再现的体外释放曲线:32°C、磷酸盐缓冲液pH 7.4、孔径为0.45 m的聚砜膜和以800 rpm的搅拌速率。按照USP1724的要求，使用这些设置进行的释放实验应能够检测成品药物释放特性的变化。将这些测试参数应用于:

a)新鲜制备的双氯芬酸钠水溶液(pH 7.4)，

b)市售的双氯芬酸凝胶

c)市售双氯芬酸药膏药

探究是否可以确定不同的药物释放特征。由此产生的释放曲线如图4-5所示。

图4为双氯芬酸钠溶液和凝胶的溶出曲线。可以清楚地看到双氯芬酸钠溶液能够迅速从膜透过，所以膜对药物从液体制剂中的扩散没有影响，这表明选择该膜是正确的。同时注意到，溶液中的双氯芬酸钠扩散到受体介质中至少需要30分钟，因此＜30分钟的取样点在局部药物的研究中无分析意义。而在各种凝胶配方中，Diclofenac- ratiopharm gel的药物释放速率最高。这与凝胶的稠度非常一致，Diclofenac- ratiopharm gel稠度显著低于所测试的所有其他配方因此其扩散速率也显著高于其他配方而低于溶液配方。

其余配方表现出相似的释放曲线。Voltaren Emulgel和Voltaren Schmerzgel的释放曲线甚至可重合，对arthrex Schmerzgel、Diclac Schmerzgel和Sandoz Schmerzgel的数据也进行了同样的比较。仔细比较这些配方的组成后，这一结果并不令人惊讶，因为两种Voltaren产品的非活性成分没有差异，arthrex Schmerzgel和Sandoz Schmerzgel的非活性成分也是如此。后两种配方的溶出曲线与Diclac Schmerzgel的相似性无法用产品的组成来解释，但由于产品注册用于相同适应症，因此很可能它们被设计为生物等效物，这可能会反映在使用Franz扩散池所获得的体外释放曲线中。

图5是乳膏的释放曲线。显而易见的是，三种双氯芬酸乳膏配方中的两种(Flector Schmerzpflaster和Voltaren Wirkstoffpflaster)也显示出重合的释放曲线。然而，基于包装说明书中给出的信息，这两种制剂由相同的双氯芬酸盐和相同非活性成分组成，因此最有可能的是，这些制剂完全相同，因此也表现出相同的释放行为。相比之下，Diclofenac-ratiopharm® Schmerzpflaster药物溶出具有溶出速率大大降低的特征，这与该制剂的组成(不同的双氯芬酸盐和不同的非活性成分)相符。

总之，在乳膏释放实验中获得的释放曲线表明，整个实验过程中，乳膏基质控制药物释放。

将双氯芬酸凝胶的释放曲线与双氯芬酸乳膏的释放曲线进行比较，显然，这两种制剂表现出不同的释放动力学。双氯芬酸凝胶中获得的大多数释放曲线可以通过绘制药物释放量对得出线性关系，表明瞬时释放速率与1 / √t成比例。对于溶液、悬浮液或乳液类型的半固体制剂系统，这种释放行为是典型的。相比之下，从乳膏的释放曲线中可以观察到几乎零级的药物释放，其中释放速率由乳膏基质控制的。

综上所述，用最优条件的IVRT测试参数获得的结果表明了，IVRT是一种可靠且具有有鉴别能力的体外研究方法，该方法适用于测定用于皮肤用的半固体双氯芬酸制剂的不同药物释放机制和释放性质。

虽然本研究中的系列实验侧重于基本方面，但对于阐明开发用于皮肤应用的半固体剂型的体外释放试验方法过程中的典型陷阱非常有用。使用不同测试参数设置获得的结果表明，选择适当的测试方法对于药物释放实验的成功至关重要。因此，本研究的结果可能对准备开发或正在开发半固体制剂的体外释放方法非常有帮助。

然而，由于药物性质和仪器细节都可能对体外药物释放研究的结果产生巨大影响，因此为本研究确定的最佳试验参数不应简单地适用于其他实验，具体的实验参数取决于垂直扩散池的尺寸和药物性质。如本文所述，应根据具体案例建立和验证最佳试验参数/条件。最后但同样重要的是，在发布扩散池实验的设置和结果时，报告所有相关的测试参数对确保所报告的测试结果的有效性至关重要。

参考文献：Influence of different test parameters on in vitro drug release from topical diclofenac formulations in a vertical diffusion cell setup

Guidance for Industry Nonsterile Semisolid Dosage Forms Scale-Up and Postapproval Changes Chemistry, Manufacturing, and Controls; In Vitro Release Testing and In Vivo Bioequivalence d0cumentation.pdf